科研 | 南京农业大学:WSL9编码对水稻早期叶绿体发育至关重要的含HNH核酸内切酶结构域的蛋白质（国人佳作）

编译：夕夕，编辑：夏甘草、江舜尧。

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导读

植物叶绿体对于光合作用和其他细胞过程是必不可少的，但是对植物叶绿体发育的生物学机制的理解还不完整。本文描述了一种新的对温度敏感的水稻突变体（wsl9），该突变体在早期叶片发育过程中会形成白色条纹，但在田间的三叶阶段后变为绿色。wsl9突变体在低温下生长时发生白化现象。wsl9基因座的基因定位和互补实验表明，wsl9编码具有HNH结构域的新型蛋白。在低温下，wsl9突变引起rpl2的剪接缺陷，但增加了rpoB的编辑效率。wsl9突变体中质体基因组编码基因，叶绿体发育基因和光合作用相关基因的表达水平发生了改变。wsl9编码含有HNH核酸内切酶结构域的蛋白质，该蛋白质对于早期叶绿体发育至关重要。 作者的研究为水稻叶绿体发育调控机制的进一步研究提供了信息。

论文ID

原名：WSL9 Encodes an HNH Endonuclease Domain-Containing Protein that Is Essential for Early Chloroplast Development in Rice

译名：WSL9编码对水稻早期叶绿体发育至关重要的含HNH核酸内切酶结构域的蛋白质

期刊：Rice

IF:5.8

发表时间：2020.7

通讯作者：万建民

通讯作者单位: 作物遗传与种质增强国家重点实验室，江苏省植物基因工程研究中心，南京农业大学

DOI号：https://doi.org/10.1186/s12284-020-00407-2

结果

1.wsl9突变体的表型特征

在白色条纹叶片突变体wsl9中研究了叶绿体发育的机制，该突变体是粳稻经EMS诱变产生的。在田间种植时，在第三叶时期，wsl9突变体叶片呈白色条纹（图1a）。wsl9突变体幼苗中的叶绿素（Chla，Chlb）和类胡萝卜素含量降低（图1b）。wsl9突变体从第四叶时期开始变绿，无法与野生型区分（图1c）。

图1 wsl9突变体和野生型的表型特征

作者通过透射电镜（TEM）比较了三叶期wsl9突变体叶片和野生型叶片的叶绿体的超微结构。野生型具有密集且正常的基粒堆（图2a,2b），而wsl9突变体则没有组织的层状结构（图2c，2d）。

图2 透射电镜图像

wsl9突变体对温度敏感。作者分别在20°C，25°C和30°C下种植了WT和wsl9突变体。在20°C下种植时，wsl9植物为白化植物（图3a），而叶绿素（Chl）含量非常低（图3b）。在25°C时wsl9植株显示出白色条纹，叶绿素含量降低（图3c，d），在30°C时，该突变体与野生型无法区分开（图3e，f）。

图3 野生型和wsl9突变体对温度的响应

2.wsl9基因座的克隆

遗传分析表明，突变表型归因于单个隐性等位基因。作者通过基于图的克隆分离了wsl9等位基因。杂交wsl9×93-11的F2群体中，wsl9位于3号染色体的indel N12和N3-11DE 89Kb的区域内。预计该区域有16个开放阅读框（ORF）（图4a）。作者对野生型和突变体的该区域进行测序，并在距ATG起始密码子383bp的ORF Os03g0169800发现一个SNP（G-T）。该SNP在突变体中会使苯丙氨酸变为半胱氨酸。作者使用dCAPs标记来确认突变位点（图4c）。

为了确认该突变是造成wsl9突变体表型的原因，作者通过wsl9等位基因转化wsl9突变体进行了互补分析。构建了2.1kb上游序列和wsl9整个编码器的互补载体，并将其引入wsl9纯合子中。9种阳性转基因植物表型与野生型相同（图3d）。这些结果表明Os03g0169800是wsl9基因。

图4 wsl9位点的图位克隆和突变体wsl9突变位点的鉴定

对NCBI数据框中wsl9蛋白分析表明，它编码了一个含有HNH结构域的为鉴定蛋白。wsl9编码的蛋白C端含有HNH结构域，因此wsl9可能具有内切酶活性。以往的报道认为大多数具有特征的HNH蛋白具有内切酶活性。然而，作者没有检测出大肠杆菌表达的WSL9的内切酶活性。未来的工作将着眼于确定WSL9是否需要其他辅助因子来作用于其内切酶活性。

3.wsl9基因表达模式

分析了叶片不同发育阶段WSL9在叶片不同部位的表达，结果表明WSL9在叶片L5处表达最高（图5a）。使用Rice XPro transcript profling数据库，作者发现wsl9在所有组织中均表达。为了进一步验证，作者使用野生型不同组织的RNA样本进行qRT-PCR。Wsl9在幼叶、根、茎、和老叶等器官中表达，而wsl9转录本优先在幼叶中表达（图5c）。

图5 wsl9的表达模式分析

4. wsl9突变体在质体转化和叶绿体蛋白合成方面存在缺陷

根据启动子的结构，质体编码基因可分为三类(class I, II和III)。当植株生长在30℃时，wsl9突变体和WT中所有基因的转录本表达模式非常相似(图6a)。然而，在20℃时，I类基因的表达水平大大降低。Rubisco activase (RCA)是核编码的可溶性叶绿体酶，在20℃时也在wsl9突变体中降低(图6b)。这些结果表明，wsl9突变体PEP活性存在缺陷。

叶绿体核糖体由50和30亚基组成。两个亚基都由rRNAs (23S、16S、5S和4.5S)和核糖体蛋白组成。使用Agilent 2100仪器分析了在20℃和30℃生长的植物中rRNAs的组成和含量。在20℃生长的wsl9幼苗中，23S和16S的rRNAs显著减少，但在30℃与WT没有差异(图6c-f)。因此，在低温条件下，wsl9突变体在质体核糖体生物生成方面存在缺陷。

图6 野生型和wsl9幼苗叶绿体基因转录本的积累

5.wsl9突变影响rpl2内含子的RNA编辑和剪接

作者试图确定wsl9的功能。基于共表达数据库和CREP模块基因相关性分析。作者发现wsp1是wsl9的共表达基因之一。WSP1与MORF蛋白质序列高度相似。尽管仅在RNA编辑中发现了MORFs，但目前已经有几个组织报道了依赖于RNA编辑时间的内含子剪接的例子。基于以上结果，作者研究了WSL9是否影响了叶绿体RNA中先前鉴定的21个RNA编辑位点的编辑。与WT相比，rpoB在C467和C560位点的编辑效率在20°C时显著提高，而其他10个基因和响应的19个编辑位点未受影响。水稻叶绿体基因组包含17个Ⅱ类内含子和1个Ⅰ类内含子。作者进行了RT-PCR，比较了ET和wsl9突变体扩增产物的长度。与WT相比，wsl9突变体的叶绿体rpl2转录本在20°C时被剪接，效率降低，而在30°C时则没有（图7）。Western blotting显示，在20℃条件下，wsl9突变株中RPL2的含量低于WT和复合植株（图8）。这些结果表明，wsl9突变体导致了rpl2的剪接缺陷，尤其是在低温条件下。

图7 不同温度下WT和wsl9突变体叶绿体转录本的剪接

图8 rpl2在WT、wsl9和补充转基因植株中的剪接分析

6. wsl9突变型和野生型在不同温度下差异表达基因

我们利用RNA-seq探究不同温度下wsl9对基因表达的影响。在20°C条件下，WT和wsl9植株共获得480M clean reads（图9）。在20°C下，共鉴定到1394个上调表达基因和1107个下调表达基因。在30°C共鉴定到888个上调表达基因和247个下调表达基因。基因富集分析显示，在20°C时，wsl9突变体中涉及生物粘附，细胞外机制，结构分子光合作用的基因显著减少。这些结果表明，wsl9突变体导致低温下许多生理过程的改变。

图9 20℃条件下野生型和wsl9突变体幼苗的RNA-seq分析

结论

WSL9基因编码一个具有HNH motif的新的蛋白。WSL9突变体在田间表现为白条表型。在控制条件下表现为温度敏感表型。需要进一步研究来揭示WSL9在叶绿体发育中的作用。