编译：思越，编辑：景行、江舜尧。
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在欧洲人群过去的几千年，2q21.3的优势进化在人体代谢功能中起到关键作用，这种长单倍型有助于他们消化牛奶中的乳糖，并以此囤积脂肪度过饥荒，以获得更大的生存优势。但在现代生活中，2q21.3基因座也与人类肥胖和II型糖尿病相关。在本篇文章中，作者对其2q21.3单倍型进行了分析，这段序列在进化的过程中高度活跃，且和乳糖酶持续现象关系紧密。此外，作者鉴定到2q21.3基因座上的MicroRNA——miR-128-1 受到正选择并且是哺乳动物关键的能量和代谢调节因子，在高脂饮食处理或瘦素编码基因突变所诱导小鼠肥胖模型中，抑制 miR-128-1 表达会增加能量消耗，改善高脂饮食诱导的肥胖，并显著提高糖耐受性及胰岛素响应。
论文ID
原名：A MicroRNA Linking Human Positive Selection and Metabolic Disorders
译名：MicroRNA与人类进化正向选择和代谢障碍相关
期刊：Cell
IF：38.637
发表时间：2020年10月
通讯作者：Anders M. Näär
通讯作者单位：麻省总医院癌症中心
DOI号：10.1016/j.cell.2020.09.017
实验设计
结果
作者首先研究了欧洲人群体中2q21.3基因座的单倍型结构，发现在R3HDM1基因为中心的长单倍型上存在强烈的突变信号（图1A），其中部分点突变靠近此前发现的，与脂质代谢高度关联的 miRNA 序列——miR-128-1，暗示2q21.3与代谢调控可能存在一定的关联性。与此同时，在人工选择和自然选择的情况中，对牛的选择压力分析发现R3HDM1与提高饲料效率和增加肌间脂肪有关，对狗的选择压力分析发现R3HDM1与体重增加有关，且都在进化过程中受到了强烈的正选择效应（图1B）。
由于观察到的成年牛和狗已经断奶，故乳糖酶持久（LP）现象不能解释这些突变在牛和狗类导致的体重差异。接着，作者利用英国生物数据库进行全表型关联分析 (PheWAS)，结果发现（图1C），长单倍型2q21.3变异与体脂表型性状有关，包括整体体脂、躯干脂肪和腿部脂肪百分比。
通过对古代欧洲不同群体的遗传信息分析发现，各个欧洲人群体的2q21.3基因座都受到了正选择，该正选择事件起始于约4000年前的草原祖先，说明该单倍型是作为一个整体进行选择的（图1D），并且与现代欧洲人中观察到的跨基因座的等位基因频率的变化一致。
图1. 哺乳动物2q21.3基因座的选择 （A）2q21.3基因座上存在强烈的正选择信号；（B）2q21.3基因座单倍型突变在欧洲人群、牛、狗进化过程中受到正选择（C）rs1438307位点的全表型相关性分析（phewas）分析，显示该基因座变异水平与人多种体-脂相关表型紧密关联。（D）对不同古代欧洲人种的DNA分析，对2q21.3基因座的进化正选择起始于约4000年前的草原祖先。
为了探索哪些细胞类型最有可能与2q21.3基因座的代谢特征相关，作者对 127 种人类细胞类型的染色质状态图谱进行了分析（图2A）,发现2q21.3基因座与血液，婴儿大脑以及包括脂肪细胞在内的间充质细胞有关。通过分析淋巴母细胞中的染色质构象数据（图2B），发现2q21.3中存在一个包含 R3HDM，miR-128-1 与 ZRANB3 的拓扑相关结构域(TAD)，并发现突变 rs1438307位于该TAD的边缘，且该TAD位于一个更大的含有RAB3GAP1的结构域中（图2C），暗示阳性选择单倍型可能与染色质可及性和整个基因座表达的改变有关。
接着，作者检测了染色质边界因子CTCF与单倍型结合的差异，发现CTCF确实优先结合rs1438307为T的等位基因，具有更高的染色质开放性（图2D），且T等位基因还与R3HDM1以及UBXN4、ZRANB3和RAB3GAP1的表达增加有关。
此外，作者通过分析GDSC数据库中984株细胞系的表达数据，发现 miR-128-1宿主基因 R3HDM1的表达与 MCM6基因的表达密切相关（图2E），并通过CCLE数据库进行了验证（图2F），说明rs1438307与与染色质结构的改变和可及性相关，通过表观遗传调控改变整个基因座的协同表达。此外，后续实验证明在miR-128-1启动子上，rs1438307的T等位基因具有更高的DNase I可及性，且EQTL分析发现miR-128-1的表达在不同2q21.3 单倍型的欧洲人的白色脂肪组织（WAT）中出现了显著差别。
综上，位于2q21.3的欧洲长单倍型与整个基因位点染色质可及性增加相关，导致miR-128-1和该基因位点共表达的基因协同上调，且 miR-128-1 的表达可能在能量消耗与代谢调节中起到了关键作用。
图2. 人类2q21.3调控回路 （A）miR-128-1周围区域127种细胞的染色质状态；（B）Hi-C分析显示2q21.3基因座区域染色质开放，其边界与rs1438307重合；（C）包含RAB3GAP1、DARS和CXCR4在内的更大的拓扑结构域；（D）含有rs1438307变异位点的ENCODE细胞系中，目标CTCF峰的强度和R3HDM1基因的表达显著增加。（E）GDSC的CellMinerCDB数据分析显示，跨越该位点的R3HDM1和MCM6的基因表达高度相关。（F）miR-128-1的表达与宿主基因R3HDM1的表达高度相关。
2 抗miR寡核苷酸促进能量消耗并减少饮食相关肥胖发生
为了探讨 miR-128-1是否在调节能量消耗和代谢控制中发挥作用，作者使用抗 miR-128-1 寡核苷酸探究miR-128-1在高脂饮食(HFD)喂养的雄性小鼠（饮食诱导肥胖(DIO)模型）中的抑制作用。通过对DIO小鼠进行16周的寡核苷酸注射后，miR-128-1在代谢组织中表达显著降低（图3A和图3B）。通过对核磁共振进行的体成分研究显示，注射后的小鼠脂肪储存量显著减少（图3C），内脏(附睾)和皮下(腹股沟)脂肪垫明显变小，且肝脏脂质堆积减少（图3D）。此外，对生热和调节能量消耗方面起着关键作用的小鼠棕色脂肪组织（BAT）中，抗miR-128-1治疗增加了棕色脂肪的生成（图3D）。
接下来，作者评估了抗mir-128-1治疗在棕色脂肪组织(BAT)、白色脂肪组织(WAT)、肝和骨骼肌等代谢组织中的表型效应。在BAT中，组织学分析显示，脂肪的积聚明显减少，并且使用识别BAT标志的抗体，解偶联蛋白1（Ucp1）显着增加了染色（图3E），且有关促进BAT细胞命运和刺激线粒体生物合成和脂肪酸β氧化的相关基因Prdm16，Ppargc1a 和 Ppara等靶点的 mRNA 水平增加（图3F）。在WAT中，抗miR-128-1治疗使DIO小鼠的脂肪细胞变小，并减少了附睾WAT中脂肪细胞周围巨噬细胞的聚集（图3G），且而编码炎性细胞因子的基因 Tnfa，Il-1b，Il-6和 Mcp1显著下调（图3H）。在肝脏中，抗miR-128-1治疗可以显著减少DIO小鼠的肝脏脂质堆积和炎症（图3I）。肝脏脂肪含量的显著减少与 Srebp1转录因子下降有关，Srebp1的靶基因Acc1和Fasn也发生了协同下降（图3J），此外与脂肪生成和脂肪储存相关的基因PPARG和FABP4的表达也降低。在骨骼肌中，抗mir-128-处理的DIO小鼠有关细胞代谢回路 pparα，pgc-1α，Ampkα2，Ucp3等基因也都发生了上调（图3K-图3M）。此外，作者也检测了这些肥胖小鼠体内的糖代谢功能。在抗 mir-128-1治疗后，肥胖小鼠体内的糖代谢紊乱得到了极大的改善。在胰岛素的刺激下，实验组小鼠的血糖控制的更加稳定，其骨骼肌与肝脏对胰岛素也更加敏感（图O-P）。
图3.对高脂饮食的小鼠皮下注射anti-miR-128-1可以缓解饮食导致的肥胖、减少内脏和皮下脂肪的增殖和炎症反应、减轻肝脂肪变和炎症，增加全身能量消耗，改善血糖稳态。（A）18周时注射anti-miR-128-1及对照组DIO小鼠。（B-D）注射组和对照组的体重、体成分和DIO小鼠组织图像。（E,G,I）BAT、EPI-Wat和肝脏组织学数据。（F,H,J）BAT、WAT炎症、肝脂肪变性相关基因的表达。（K-M）与葡萄糖稳态和能量消耗相关的肌肉中标记基因和蛋白表达。（N）注射组和对照组的全身能量消耗差异。（O-P）注射组和对照组葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验。
3 miR-128-1是糖稳态和胰岛素敏感性的关键调节因子
肝脏和骨骼肌中的肥胖和异位脂肪沉积常常与胰岛素抵抗和葡萄糖控制不良有关，并且是II型糖尿病（T2D）发展的主要危险因素。为了进一步确定 miR-128-1在肥胖相关的葡萄糖异常中的作用，作者对经过抗miR-128-1和对照抗mir治疗的DIO小鼠进行了高胰岛素-正葡萄糖钳夹试验，在抗miR-128-1小鼠中，除了体重的降低和脂肪的减少（图4A-B），在胰岛素刺激的全身葡萄糖代谢中表现出显著的改善（图4C-E），以及在骨骼肌中2-脱氧葡萄糖摄取的增加(图4F)和肝脏葡萄糖的生成抑制(图4G)。此外，抗miR-128-1治疗还表现出Wat胰岛素敏感性的增加和包括WAT对2-脱氧葡萄糖的摄取增加(图4F)以及增强WAT对非酯化脂肪酸（NEFA）释放的抑制作用（图4H），证明miR-128-1在调控葡萄糖稳态的代谢回路中的关键作用。因此，食物诱导的小鼠肥胖模型证明了miR-128-1能够改善肥胖小鼠的代谢状态，缓解胰岛素抵抗和炎症等病理反应。
图4.抑制了miR-128-1的小鼠在高脂饮食状态下肥胖程度减轻，肝脏、骨骼肌及脂肪组织的胰岛素敏感性更高。（A-B）抑制组小鼠的体重、体脂百分比。（C-E）高胰岛素-正血糖钳夹期间的血糖浓度变化，以及维持正常血糖所需的葡萄糖输注速率、稳态葡萄糖输注速率。（F）骨骼肌和白色脂肪组织的葡萄糖摄取。（G-H）钳夹期间内源性葡萄糖和血浆NEFA的生成抑制。
4 敲除miR-128-1证实了miR-128-1的“节俭”特性
为了证实 miR-128-1在控制体内能量消耗方面的作用，作者构建了miR-128-1敲除（KO）的突变体小鼠。与野生型相比，高脂饮食饲喂下miR-128-1 KO小鼠的体重增加程度及WAT体积明显小于野生型（图5A-B），且miR-128-1 KO 小鼠能量消耗明显增加，但对活动没有明显的影响(图5C 和5D)，并表现出更强的耐寒功能（图5E），且BAT细胞内脂肪显著减少（图5F）并具有更大的线粒体耗氧率和能量消耗（图5G）。此外，与寡核苷酸进行敲除的DIO小鼠类似，KO小鼠也表现出显著的葡萄糖稳态改善和对胰岛素的反应增加(图5H和5I)。因此，miR-128-1是一种“节俭型”miRNA，能通过降低能量消耗水平及促进脂肪储存调节哺乳动物的系统性代谢。
图5.敲除miR-28-1使高脂饮食状态小鼠增加全身能量消耗，改善血糖稳态。（A-D）对照组和敲除小鼠的体重、体成分变化、全身能量消耗和活动差异。（E）冷暴露下两组小鼠的直肠温度变化。（F）Ucp1免疫组化。（G）棕色脂肪细胞能量消耗差异。（H-I）葡萄糖耐量和胰岛素耐量试验
5 miR-128-1调节白色脂肪的分化和功能
接着，作者研究了miR-128-1调节细胞代谢的分子机制。在WAT细胞分化过程中，过量的miR-128-1处理会抑制来源于WAT的初级脂肪细胞的分化水平，导致脂肪生成减少，脂肪细胞数量减少，并降低WAT分化过程中关键调节因子PPARG，CEBPA，FABP4，PPARGC1A和PPARA，以及脂联素脂联素（ADIPOQ）和瘦素（LEP）的表达水平(图6A和6B)。但是，抑制miR-128-1表达能够诱导初级脂肪细胞的分化，并增加成熟Wat相关基因的表达(图6C和6D)，miR-128-1能够直接或间接调节瘦素和脂连蛋白的表达（图6E和图6F）。此外，改变miR-128-1水平对AMPKα2、pGC-1α、SIRT1、PPARα、PPARγ、INSR和IRS1等靶蛋白的水平也会发生改变(图6G)， 并能抑制WAT来源的脂肪细胞中的脂肪酸氧化水平（图6H和图6I）。
图6.调控人前成脂细胞miR-128-1水平可改变脂肪细胞分化、瘦素和脂联素分泌以及脂肪氧化代谢。（A-D）过表达前miR-128-1抑制人脂肪细胞分化，下调脂肪细胞标志基因表达，抗miR-128-1促进人脂肪细胞原代分化，上调脂肪细胞标志基因表达。（E-F）经miR-128-1前体和抗miR-128-1处理后，人原代脂肪细胞瘦素和脂联素分泌水平变化。（G）原代人脂肪细胞中脂肪细胞基因的水平。（H-I）过表达miR-128-1或敲除miR-128-1对原代人类脂肪细胞FAO的影响。
6 miR-128-1抑制棕色脂肪细胞的命运和能量消耗
考虑到抗miR-128-1治疗的中观察到的对BAT分化和能量消耗的影响，作者评估了miR-128-1在调节棕色脂肪细胞体外分化中的分子机制和功能。在BAT细胞的分化过程中，发现miR-128-1的缺失导致分化为成熟棕色脂肪细胞的能力显著增强(图7A)，并通过海马分析结果显示miR-128-1基因缺失小鼠的棕色脂肪细胞能量消耗增加(图7B)。并发现，棕色脂肪标志基因Prdm16、Ucp1，以及参与脂肪细胞命运决定和调节脂质稳态和能量消耗表达程序相关基因PPARG、Ppara、Ppargc1a)的表达增加（图7C-G）。
因此，miR-128-1能通过细胞自主性方式抑制前体细胞分化产生BAT细胞的能力，并抑制BAT细胞的能量代谢。接着通过加入棕色脂肪诱导剂DBcAMP对比发现，pre-miR-128-1 的加入也能在棕色脂肪细胞中有效的影响其目标基因 Pparg, Ppara 和 Ppargc1a 的表达，而这些基因直接决定能量消耗的多少（图7H-J）。此外，将抗miR-128-1基因导入成熟分化的小鼠棕色脂肪细胞，可显著抑制这些基因的表达(图7K-7M)。细胞谱系追踪研究表明，棕色脂肪细胞可以来自Myf5阳性的骨骼肌前体谱系。体外研究还表明，小鼠C2C12肌肉前体细胞系可以分化为棕色脂肪细胞。作者发现，抗miR-128-1处理的C2C12细胞显著促进了棕色系的融合和向成熟棕色脂肪细胞的分化，并促进了如Prdm16，Ucp1，CIDA，Elov13，Ppargc1a，Ppara等棕色脂肪标志基因的表达（图7N-R）。此外，抑制miR-128-1的表达会促进C2C12细胞的脂肪酸氧化及能量消耗，并提高C2C12细胞分化产生BAT细胞的能力（图7S-T）。因此，miR-128-1能通过细胞自主性方式抑制前体细胞分化产生BAT细胞的能力，并抑制BAT细胞的能量代谢。
结论
本研究通过将基因组水平上的分子进化分析与代谢分析相结合，并利用多种小鼠代谢异常模型及突变体模型，将2q21.3基因座的优势进化与异常代谢联系起来，并揭示了该基因座中的miR-128-1在哺乳动物能量消耗与储存中的关键作用，细胞与动物实验直接证明了作为 miR-128-1 在能量代谢，脂质代谢以及糖代谢中的关键作用。该研究也在分子层面揭示了 miR-128-1 是如何通过调控 BAT 的细胞命运来改变这些表型。从进化角度上说，miR-128-1表达水平的改变在古代有助于囤积脂肪度过饥荒，以获得更大的生存优势，但是在物质水平丰富的现代生活中，又会造成人类代谢适应性下降，甚至导致肥胖和2型糖尿病等代谢疾病，并可能作为一个潜在的治疗靶点。
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