编译：微科盟稻和，编辑：微科盟景行、江舜尧。
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前列腺癌存在显著的临床异质性，表现为空间和克隆基因组的多样性。但相比之下，人们对前列腺肿瘤转录组的异质性了解甚少。在这里，研究人员对13个前列腺肿瘤的36424个单个细胞的转录组进行了分析，并确定了上皮细胞是疾病侵袭性的基础。肿瘤微环境(TME)显示了多个进展相关的转录程序的激活。值得注意的是，研究人员还观察到了KLK3的混杂表达，并验证了癌细胞改变T细胞转录组的能力。对一个原发性肿瘤和两个相应淋巴结的分析表明，KLK3异位表达与微转移有关。胞间存在着密切的细胞间通信。研究人员发现了一个与肿瘤细胞拥有活跃通讯的内皮细胞亚群(激活内皮细胞，aECs)。通过对另外11个样本的测序，研究人员发现aECs在去势抵抗性前列腺癌中富集，并促进癌细胞侵袭。最终，研究人员提供了一个全面的人类前列腺单细胞基因表达图谱，并揭示了一个高度异质性的前列腺癌特异性转录组。此外，研究人员还为前来探索测序数据的用户创建了一个友好的web界面。
论文ID
原名：Single-cell analysis reveals transcriptomic remodellings in distinct cell types that contribute to human prostate cancer progression
译名：单细胞分析揭示不同类型的细胞转录组重塑有助于人类前列腺癌的进展
期刊：Nature Cell Biology
IF：20.042
发表时间：2021年1月
通讯作者：任善成
通讯作者单位：上海市长海医院泌尿外科
DOI号：10.1038/s41556-020-00613-6
实验设计
结果
1 前列腺癌单细胞图转录组图谱
为了了解前列腺癌在单细胞分辨率下的异质性，研究人员从12名患者中收集了13个组织样本(12个原发性和1个淋巴结转移)并进行单细胞RNA测序，经过数据标准处理与质控，研究人员获得了36424个细胞的转录组表达谱。通过tSNE降维，研究人员获得了7个细胞群。接着，研究人员利用20个细胞类型信号生成了详细的细胞身份注释并且发现腔细胞表达T细胞共刺激基因，暗示着上皮细胞可能参与抗原呈递过程（图1a,1b）。非上皮细胞相交于上皮细胞呈现更低的表达复杂性（图1c）。拷贝数差异的推测也表明腔室细胞表达偏差显著增高（图1d）。那是否非恶性的上皮细胞会影响腔室细胞的表达谱，研究人员通过对个体肿瘤的细胞组成分析发现个体肿瘤细胞组成具有显著差异性（图1e）。
图1. 前列腺癌单细胞图谱的概述。 a；36424个单细胞的tSNE降维视角。b；每个细胞类型的标记基因表达，圆点大小和颜色分别代表标记基因表达的百分比和平均比例的表达值。c；所有细胞的tSNE降维视角。d；每个细胞的CNA，使用推断的拷贝数计算。e；每个病人样本的细胞组成分布。样品是根据Gleason评分确定的。
2 肿瘤亚型下固有的上皮细胞亚群
考虑到基质成分可能对某些bulk测序衍生的信息产生主要贡献，研究人员尝试进一步解析侵袭性肿瘤的上皮亚群，并建立前列腺癌的纯化标记。研究人员通过tSNE进一步对包括基底/中间层和管腔型的上皮细胞重新进行亚分群，产生了16个细胞簇（图2a）。为了确定细胞亚群与不同临床结果的关系，研究人员比较了各个细胞簇中多种前列腺癌亚型相关信号的表达。Cluster10单独具有基底/中间层特异性标记基因（KRT5、KRT14、KRT19和TP63）的高表达，被命名为基底/中间层细胞（图2b）。Cluster12高表达细胞分裂相关基因，因此被命名为细胞周期细胞。与其他管腔细胞相比，细胞周期细胞和基底/中间层细胞表现出独特的细胞功能。细胞周期细胞的氧化磷酸化和DNA复制功能丰富，而一般管腔细胞功能枯竭，基底/中间层细胞特别与抗原的处理和递呈有关（图2c）。与之前的研究一致，细胞周期细胞与基底/中间层细胞是多个队列疾病预后的预测因子（图2d、2e）。由于基底/中间层细胞表现出抗原处理和提呈基因的高表达，研究人员发现基底/中间层细胞是CCL2表达的主要细胞群，而在基底/中间层细胞含量最少的两个样品中，CCL2表达均未检测到（图2f、2g）。在相应Bulk测序的数据中，研究人员还发现CCL2的表达以及T细胞信号也与基底/中间层细胞的含量显著相关（图2h、2i）。总之，这些结果表明基底/中间层细胞吸引免疫细胞，这可能在一定程度上有助于高/中等得分患者的良好预后。
图2. a；23674个上皮细胞的tSNE降维视图。 b；三种上皮细胞亚型的标记基因表达。c； 上皮细胞亚型之间的差异激活通路。 d-e； 比较高和低的生化复发率(BCR)，使用TCGA中的细胞周期(d)和基底/中间层(e)特征分层。f；CCL2表达的平滑分布，TME和上皮细胞分别按其指定的细胞类型和集群分组。g；不同样本中CCL2表达的平滑分布(顶部)和基底/中间细胞数量的条形图(底部)。h；TCGA中CCL2表达与基底/中间层信号的相关性。i；T细胞与基底/中间层信号的相关性。
3 肿瘤相关的巨噬细胞显示破骨细胞样特征与浸润的CD8+效应T细胞表达肿瘤标记基因
由于肿瘤微环境（TME）中的免疫细胞在肿瘤进展中起着复杂的作用，因此研究人员使用单细胞数据来研究浸润免疫细胞的异质性。为了更好的描述髓系细胞亚群，研究人员利用tSNE对髓系细胞进行分群并将它们的平均丰度与分选细胞的整体丰度进行了比较，并检查了典型标记基因的表达（图3a、3b）。其中，所有簇状细胞均表现出高水平的HLA-DRA和CD68，单核细胞均表现出高水平的CD14和FCGR3A，但树突状细胞未表现出，0、2、4、5和6簇细胞表达与巨噬细胞相关基因，表现出巨噬细胞的特征（图3c）。总之，研究人员将这些细胞分为三种亚型:单核细胞、树突状细胞(DCs)和肿瘤相关巨噬细胞(TAMs)。TAMs中存在M1和M2信号激活的混合，且两种信号之间存在很强的正相关(图3d)，与最近对人类癌症的研究发现TAMs共表达M1和M2信号一致。然而，TAM簇细胞之间存在显著的异质性，许多参与巨噬细胞功能和激活通路的信号被不同调节（图3e）。根据标记基因的表达情况，T细胞可分为CD4+T常规细胞(Tconv)、CD4+T调节细胞(Treg)、CD8+T天然细胞和CD8+T效应细胞（图3f、3g）。Cluster 5是活化程度最低的亚型，大多数代谢和免疫通路水平最低，而Cluster 3则表现出高活化T细胞的特征（图3h）。值得注意的是，研究人员观察到了编码前列腺特异性抗原(PSA)的KLK3基因在Cluster 3和Cluster 5簇以及Treg细胞中高表达。为了了解这种意料之外的KLK3表达的潜在机制，研究人员进行了基因共表达分析，以确定高度相关的基因模块，并关注那些显示亚型或集群特异性激活的基因模块。模块61是唯一特异于KLK3高T细胞簇的细胞，其梯度激活与KLK3丰度相对应，该模块与细胞外囊泡(EV)和外泌体有关（图3h）。因此，研究人员假设CD8+T细胞中肿瘤特异性基因表达的积累是由肿瘤来源的ev介导的。
图3. scRNA-seq揭示免疫成分的异质性。 a；单核细胞的tSNE降维视图。b； 不同分类免疫细胞上单核细胞簇与整体RNA-seq的相关性。c；平滑分布的单核细胞相关标记基因丰度。d； M1和M2信号之间的相关性，其中每个点代表一个细胞。双侧P值计算Spearman等级相关性，不调整为多重比较。e； 所有TAM簇之间激活通路的差异。f-g； 3116个 T细胞tSNE降维视图，重新评估簇通过颜色编码(f)和标记基因的表达水平（g）。h；不同t细胞亚群的表征，按集群顺序和亚型分组。
4 起源于前列腺癌细胞的EVs诱导T细胞中KLK3的表达，KLK3的异位表达与微转移有关
为探究T细胞上皮肿瘤标记物的积累是否仅限于前列腺癌，研究人员分析了另外四种癌症类型的公共scRNA-seq数据，发现四种癌症类型中均存在T细胞中肿瘤标记基因的表达(图4a)，表明这可能是浸润性T细胞转录组的一般特征。接着，研究人员进一步探究了病人样本中浸润T细胞肿瘤标记基因的存在与来源。KLK3阳性T细胞特异性模块61 特异性表达PMSA，因此研究人员通过流式细胞术从肿瘤组织中分选了阳性PMSA T细胞并利用qRT PCR验证PMSA阳性细胞高度表达KLK3，而非阴性细胞（图4b）。为了检测肿瘤细胞改变T细胞基因表达谱的能力，研究人员培养了从健康捐赠者中分离的T细胞和两种前列腺癌细胞系，发现AR阳性的C4-2B细胞系令T细胞KLK3表达显著增加,而DU145细胞系并不能显著影响（图4c）。此外，从C4-2B细胞系中分离出含ev的颗粒，而非DU145细胞培养上清，也能检测到T细胞中的KLK3表达显著增加（图4d、4e）。总之，以上数据表明前列腺癌细胞分泌的EVs可以改变浸润性T细胞的转录组。接下来，研究人员进一步探究了EVs是否会影响附近淋巴结(LNs)，影响程度如何。磁共振成像(MRI)和组织病理学分析均未见原发性前列腺肿瘤与两个髂外闭的孔淋巴结转移（图4f）。有趣的是，研究人员在左侧淋巴结中发现了少量上皮细胞，但在右侧淋巴结中未发现(图4g)。CNA推断分析表明淋巴微转移于左侧LN（图4h）。此外，研究人员还观察到KLK3在所有细胞类型中广泛表达，其中数量最多的是T细胞(1209)，存在于左侧淋巴样本中，而非右侧淋巴样本中（图4i）。这表明LNs中免疫细胞基因表达的改变可能发生在实际转移发生之前，从而有可能建立转移前生态位。
图4. T细胞中肿瘤来源的ev运输外源性KLK3表达。a；上皮肿瘤标记物在不同癌症类型的T细胞中的表达。b；新鲜前列腺肿瘤PSMA阳性(+)和阴性(-)T细胞中KLK3水平的rtPCR分析比较。c；与前列腺癌细胞DU145和C4-2B共孵育后的T细胞与对照组的KLK3水平的rtPCR分析比较。d；与前列腺癌细胞DU145 (eDU145)和C4-2B (eC4-B)分泌的EV共孵育后的T细胞与对照组的KLK3水平的rtPCR分析比较。e；RNA荧光原位杂交(FISH)分析显示T细胞的KLK3定位 f；苏木精和伊红(H&；E)染色(顶部；比例尺，50 μm)和磁共振成像(MRI；下)结果显示，左、右盆腔淋巴结均未见转移。g；右(R)、左(L)淋巴结及原发肿瘤(T)上皮细胞数。h；平均CNA偏差与原发肿瘤样本中每个细胞的上皮细胞平均CNA谱的相关性绘制。i；三个样本中klk3阳性细胞数。
5 scRNA-seq揭示了TME中与癌症相关的成纤维细胞的异质性以及激活的ECs修饰肿瘤细胞外基质
接下来，研究人员探究了TME的非免疫成分，包括成纤维细胞和内皮细胞(ECs)。越来越多的证据表明，癌症相关的成纤维细胞(CAFs)在前列腺癌进展中的重要作用，基于scRNA测序的研究扩大了我们对其在其他癌症类型中的异质性的理解。研究人员鉴定出948个成纤维细胞，根据各簇间的相似性和关键标记基因的表达情况，将5个不同的聚类分为3个亚型（图5a、5b）。研究人员进一步对每个CAF亚型中表达量最高的150个基因进行基因富集分析，发现血管生成相关基因富集于所有亚型中，而肌成纤维细胞、细胞粘附和细胞外基质(ECM)相关基因存在亚型特异性（图5c）。虽然还需要更多的工作来阐明前列腺癌中肌成纤维细胞CAFs的实际来源，但研究人员的数据为TME中CAFs和非成纤维细胞谱系之间共享的调控网络提供了证据。研究人员接着检测到3115个ECs，并将其进一步划分为6个细胞簇（图5d）。研究人员观察到内皮标记基因PECAM1普遍表达于各个细胞簇，FLT1的存在和PDPN表达的缺失表明ECs来自血管而不是淋巴管，与活化CAFs相关的基因在EC亚群中高度表达（图5e）。研究人员将这四个表达CAFs标志物的EC簇命名为aECs。研究人员进一步对aECs进行伪时间分析，揭示了6个细胞簇的分化方向（图5f）。差异基因表达分析将这6个簇归为与伪时间状态一致的4个亚型（图5g）。差异基因表达分析进一步表明ECs和aECs间的配体与受体显著失调，研究人员进一步通过CellPhoneDB推测出aECs与上皮细胞有更多的相互作用（图5h）。此外，aECs具有大部分来自经典ECs和成纤维细胞的相互作用（图5i）。aEC独特的一对是诱导了人类ECs的迁移和入侵的BMP2和I/II型BMP受体之间的相互作用（图5j）。0簇和1簇中富集的通路大多与免疫相关，但aECs中最常见的通路是ECM受体信号通路和局灶性粘附信号通路（图5k）。总之，这些数据表明aECs修改ECM，同时进一步下调免疫激活。
图5.基质细胞中激活EC细胞亚群的确定。 a； CAF细胞tSNE降维视图，亚群通过颜色编码。b；CAF细胞tSNE降维视图，指定标记基因通过颜色编码。c；每个CAF子集最丰富的5个基因本体论(GO)术语。d-e； 3115个ECs的tSNE降维视图，重新评估群集的颜色编码(d)和标记基因的表达水平(e)。f； 所有的ECs都沿着伪时间轨迹排列，细胞用簇色标记。g；EC亚型间差异表达的代表性膜蛋白编码基因的平滑分布。h； 每种细胞类型中独特的细胞通信对的数量。i； 从成纤维细胞、典型的ECs和激活的ECs (aECs)到上皮细胞的独特的传出细胞通信对的重叠。j；aEC特定的传出细胞通信对。k；ECM受体相互作用和局灶性粘附通路基因在典型ECs和aECs中表现出差异表达。
6 aECs在CRPC中富集，促进癌细胞侵袭
考虑到aECs具有转移相关的信号，并且癌细胞可以诱导ECM的重塑以促进疾病扩散，研究人员假设aECs与更具侵袭性的前列腺癌相关。研究人员对膀胱癌根治性膀胱切除术中获得的6个前列腺组织和5个CRPC患者的肿瘤进行了scRNA-seq（图6a、6b）。为了更好地表示前列腺的空间异质性，研究人员从每个前列腺的左、右外周区收集样本并分别测序，发现正常的CRPC队列中检测到类似aEC人群的thy1阳性亚群（图6c）。两个aEC簇(0和1)主要由来自CRPC样本的细胞组成，伪时间分析显示从经典EC到aEC的进展，这与簇中CRPC细胞百分比的增加高度相关（图6d）。在aEC亚群中，研究人员也观察到ECM受体相互作用和粘附通路的激活（图6e）。接下来，研究人员在新鲜的人类肿瘤样本中验证了aECs与CRPC的关联，发现与ADPC和正常前列腺样本相比，从CRPC中分离出的aECs明显更高（图6f、6g）。为了了解aECs对癌细胞的影响，研究人员利用体外共培养系统发现在aEC共培养条件下，癌细胞入侵显著增加（图6h）。
图6. aECs经历了ECM重塑并且富集于CRPC中 。a-b； 正常CRPC样本ECs的tSNE降维视图，群集(a)和标记基因表达(b)通过颜色进行编码。c；QuSAGE得分，表示批1和批3数据中EC集群之间的相似性。d；顶端 :所有正常crpc样品的ECs沿着伪时间轨迹排列。底端：轨迹示意图，用平均伪时间和CRPC样本中细胞的百分比表示的饼图颜色编码。e；所有7个EC簇之间的局灶粘连激活和ECM受体相互作用通路的差异。f；流式细胞术点图显示正常、原发性前列腺癌(ADPC)和抗去势前列腺癌(CRPC)样本中CD31+和CD90+aECs的百分比。g； f中aEC百分比的定量。h； PC3与亲本或CD31+/CD90+aEC细胞共培养后的入侵场数。
讨论
单个前列腺肿瘤在空间和克隆上具有高度异质性，并且患者之间的疾病差异很大。Bulk测序在细胞混合物中只能获取平均信号，限制了对前列腺肿瘤异质性的评估。研究人员使用scRNA-seq生成了一个包括原发性前列腺癌、转移癌以及正常的非癌前列腺组织单细胞转录组图谱。这些数据使研究人员能够在不同的细胞类型中识别出意料之外的生物学特征。
研究人员在一样本中观察到基底/中间细胞类型是主要的上皮细胞类型，这与之前前列腺癌中基底细胞缺乏和管腔细胞扩张的发现相冲突。然而，这里鉴定的基底/中间细胞在转录组上与KRT5、KRT14和TP63较少的非转化前列腺基底细胞不同，这可能导致组织病理学分析中检测为阴性。此外，罕见表达的p63蛋白与高级别肿瘤相关的这一事实与研究人员的观察结果一致。基于同一细胞群(细胞周期)广泛侵略性播散于多个样本中与多个TME活动相协同，研究人员将目光聚集在TME上。研究人员观察到肿瘤引起免疫细胞紊乱。在非上皮亚群中发现了高水平的KLK3。T细胞中KLK3的丰度增加，效应细胞的溶细胞活性在下降之前就会增加。此外，KLK3的异位表达可以为临床提供额外的推论。临床前研究显示了量化盆腔LN中的KLK3检测微转移的前景。在这里，研究人员的工作暗示了淋巴结转移分子分析的可能机制，在实际转移发生之前，TME中有一个有利的生态位，允许肿瘤来源的ev或肿瘤教育的免疫细胞引导肿瘤细胞迁移到附近的淋巴结。研究人员检测的右侧淋巴结中未观察到微转移的免疫细胞中检测到KLK3的异位表达，这一事实进一步支持了这种假设。
研究人员用膀胱癌患者的良性前列腺组织作为对照。尽管获取健康捐赠者的正常前列腺组织很有挑战性，但这对于进一步验证这些观察结果和排除膀胱肿瘤对前列腺微环境的潜在影响极其重要。总之，研究人员已经揭示了原发性肿瘤中多个转移相关转录程序被激活的转录组特征。研究人员的数据呼吁更大的前列腺癌单细胞测序与可靠的相关临床数据，以促进治疗靶点的识别和侵袭性疾病的生物标志物的发展。
结论
本文研究人员通过合理巧妙地设计实验，结合单细胞转录组测序揭示了不同细胞类型转录组重塑有助于人类前列腺癌的进展。研究人员不仅确定了上皮细胞是疾病侵袭的基础，并揭示了肿瘤微环境中存在多个与前列腺癌进展相关的转录程序的激活以及前列腺癌转移的分子机制。此外，研究人员还发现了一个与肿瘤细胞拥有活跃通讯的内皮细胞亚群，该内皮细胞亚群促进癌细胞侵袭。这些研究发现对前列腺癌的临床治疗以及预后提供了新的视角。
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