技术分享 | 原位杂交HER2异质性定义及报告

含曲妥珠单抗的治疗是HER2 乳腺癌患者的标准治疗。可以使用原位杂交来评估HER2基因扩增，但在具有17号染色体多体性或肿瘤内遗传异质性的肿瘤中，原位杂交结果的解释具有挑战性。

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定义 HER2 GH

HER2遗传异质性（HER2 geneticheterogeneity，HER2 GH）包括肿瘤内异质性和肿瘤间异质性。肿瘤内异质性指单个肿瘤中同一或不同区域内出现的HER2基因状态的差异（图1）；肿瘤间异质性指原发肿瘤和转移肿瘤间的差异。

2009年ASCO/CAP明确了 HER2 遗传异质性的判断标准——若5%~50%的浸润性癌细胞中出现FISH双探针法HER2/17比值>2.2或单探针法HER2拷贝数>6.0个/细胞核，则判断肿瘤存在异质性；存在异质性的病例中，整个肿瘤HER2扩增状态仍根据《ASCO/CAP指南》分别评判HER2阴性、不确定或阳性。

2013 年ASCO/CAP更新了乳腺癌 HER2 检测指南，FISH结果判定界值发生变化。但是对于HER2 GH没有更新。

2018 年 ASCO/CAP 指南将基因组异质性(GH) 定义为具有 HER2 扩增的离散肿瘤细胞群。

英国乳腺癌/胃癌HER2 ISH检测实践指南^[1]则认为同时包含不同的克隆或扩增和非扩增肿瘤细胞混合的病例应报告为异质性扩增。强调检测时要扫描整个载玻片，识别明显异质性区域。需要对来自三个区域的 20-60 个不重叠的侵袭性癌细胞核单独计算HER2/CSP17 比值；如果有证据表明区域间存在异质性，则计算额外细胞（每个区域至少 20 个）和/或区域（最多 6 个）。对于具有不同亚克隆（胃癌或乳腺癌）的异质病例，分别报告每个亚克隆的平均 HER2/CSP 17 比值和计数细胞数。如果任一区域的平均 HER2/CSP17 比值≥ 2.00，则该肿瘤应被视为扩增。指南特别强调，胃癌中扩增的细胞可能出现在较小的团块或区域，但认为是具有临床意义，需谨慎报告。

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HER2 GH表现及影响

对于遗传异质性的定义在应用中仍存在一些分歧。2010年2月，Chih-Yi Hsu^[2]提及遇到的一个案例，样本中计数60个浸润肿瘤细胞，其中34个细胞（56.7%）HER2 /CEP17信号比为2.3，26个细胞（43.3%）信号比为1.0，而总体比为1.76。因为超过 50%(56.7%) 的肿瘤细胞信号比高于 2.2 (2.3)，所以它不被认为是HER2 GH，且判断为HER2扩增。可基于ASCO/CAP HER2判断标准，总HER2 /CEP17比值小于 1.8(1.76)，应该判断为HER2无扩增。显而易见的是这个肿瘤是由两种HER2状态不同的肿瘤细胞组成，50%作为HER2 GH判断的标准会存在问题。文中作者建议将HER2 GH指南修改为“超过 5% 但低于 95% 的浸润性肿瘤细胞的HER2 /CEP17 比值高于 2.2”。

Bernasconi B^[3]发现，HER2检测中可能观察到弥漫性扩增克隆（超过 5% 的扩增细胞分布在所有肿瘤区域）、局部扩增克隆（超过 5% 的扩增细胞聚集在特定肿瘤区域或特定切片中）和小扩增克隆（小于 5% 的扩增细胞成簇或与不同肿瘤区域的未扩增细胞混合）。强调识别乳腺癌异质状态在原发性和转移性癌症的管理中非常重要。当使用双色FISH探针进行HER2检测时，最终的HER2状态取决于评分区域，但考虑到单个随机选择的组织切片中可能会遗漏或未充分代表局灶性扩增的小群体，需要将扩增细胞的分布、扩增细胞的数量、扩增的类型（低级或高级）以及17号染色体多体性都考虑在内。

HER2异质性可能会导致IHC与原位杂交、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致，会影响对HER2结果的判断。一般来说，乳腺癌GH是由克隆多样化和基因组成的差异导致的，这是由于肿瘤某些细胞的遗传不稳定性增加所致。文献中报道的肿瘤内HER2扩增遗传异质性的发生率约为5%至30%。HER2扩增细胞^[3]（图1）可能呈现弥漫性、聚集在特定区域、与未扩增细胞混合或局限于转移性淋巴节。存在遗传异质性和多体性的情况下正确评估比值有助于准确评估 HER2 状态，并可能影响适当抗 HER2 治疗的选择。

图1（乳腺癌）HER2异质性示意图[10.1038/modpathol.2013.103]

(a) HER2未扩增基因同质的肿瘤；(b) HER2 扩增的基因同质肿瘤；(c) 具有“马赛克”模式的基因异质性肿瘤，其中扩增和未扩增的克隆混合在一起；(d)扩增细胞被非扩增细胞包围的基因异质性肿瘤。蓝色多边形代表具有正常 HER2:CSP17 比值 (≤2.2) 的细胞核；红色多边形代表具有升高HER2:CSP17比率 (＞2.2) 的细胞核。

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检测及HER2 GH报告

检测的一般流程：

1. 浏览全片：在选择分析区域前应对整个切片进行浏览，避免漏过遗传异质性区域。若发现异质性扩增，通过HE或IHC确定浸润性癌区。

2. 选择区域：选2~4个代表性区域；若发现有明确的HER2阳性肿瘤细胞，该区域必须被选取；需要有足够的分析区域，且每个区域至少计数 20 个细胞，如果存在异质性的现象，需增加分析区域及计数细胞数量。如果可能，需检测更多的组织以及转移淋巴结组织。

3. 信号计数：分别计数HER2、CSP 17拷贝数和比值。

如果一个肿瘤中扩增细胞呈现聚集克隆状态，可判定该肿瘤为HER2扩增，并且扩增克隆细胞独立于其他区域计数。

如果肿瘤扩增细胞呈现散在、单个的状态，至少计数 60 个细胞的平均 HER2/CEP17比值，以判断HER2 状态。

如果仅有 1~10%细胞出现 HER2 扩增时，如果可能，需在肿块不同区域或转移灶重复 ISH 检测。当仍然仅有 1~10%细胞出现 HER2 扩增，结果应认为 HER2 阴性，并且扩增细胞比例应该附在病理报告内。当这些患者出现转移时，需复测 HER2 状态，因为他们很可能从靶向用药中获益^[4]。

同一病例HER2检测不一致的，存在肿瘤异质性扩增的、假阴性病例，建议使用第二蜡块重新检测；穿刺样本FISH检测时，若送检两个部位，尽量放在一起检测；对于阴性诊断时必须浏览全片，排除局灶或个别阳性可能；局灶阳性也可能是导管内癌成分，需要通过IHC仔细区分；而肿瘤异质性的判读应由多人完成，判读应严格参照指南程序。

HER2 FISH报告中要求包括对于肿瘤异质性的描述，例如，所占比例、两群细胞的HER2，CSP 17拷贝数及比值、异质性扩增的细胞是弥散分布还是成簇分布、是否有组织学改变等。

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HER2 GH图谱展示

图2（乳腺癌）不同方法对基因异质性肿瘤的分析[10.1038/modpathol.2013.103]

 (a) 免疫组织化学 (IHC)，(b) 双色荧光原位杂交结合IHC染色【HER2 蛋白过度表达（绿色膜染色）和 HER2 基因扩增（红色信号）】。(c) 使用双半抗原、双色原位杂交（HER2，黑色染色；染色体计数探针 17，红色染色）分析遗传异质性肿瘤。

图3（乳腺癌）HER2异质性扩增不同模式[10.1309/AJCP0EN6AQMWETZZ]

A，肿瘤内表现出 2 个不同的克隆，一种扩增，一种HER2缺失。B，在未扩增细胞的背景上存在着高度扩增的肿瘤细胞。C，大约10%细胞显示HER2/CEP 17比率 >2.20（箭头）。D，少于10%的细胞显示HER2/CEP 17比率 <2.20（箭头）。

图4 一例HER2表达和扩增的异质性非典型模式图--结直肠癌(a–c)和肝脏转移(d–f)[ 10.1038/modpathol.2015.98.]

(a, b, d, e) VENTANA 4B5 在x4 (a, d)和x20 (b, e) 处的HER2蛋白表达。

(c, f)荧光原位杂交在x63 HER2基因扩增。

图5（结直肠癌）HER2/neu ISH检测图[10.1038/bjc.2014.483]

使用 HER2（绿色）和 17 号染色体计数探针（红色）双色显色原位杂交 (CISH) 分析 HER2/neu 扩增，揭示 HER2/neu 扩增阴性 (A) 和阳性 (B)。通过IHC (C) 和 CISH (D) 检测的遗传异质样本。

图6（结直肠癌）FISH检测结果[10.1016/j.humpath.2010.02.018]

FISH 分析显示 CRC 中 HER-2（红色信号簇）的同质(A) 和异质 (B) 扩增。

参考文献

[1] Bartlett JMS, Starczynski J, AtkeyNet al.(2011). HER2 testing in the UK: recommendations for breast and gastric in-situhybridisation methods. Journal of Clinical Pathology, 64(8), 649–653.doi:10.1136/jcp.2011.089847 

[2] Chih-Yi Hsu,Anna Fen-Yau Li, Ching-Fen Yanget al.(2010) Proposal of Modification for theDefinition of Genetic Heterogeneity in HER2 Testing in Breast Cancer. Arch PatholLab Med,134 (2): 162. doi: https://doi.org/10.5858/134.2.162.a

[3] Bernasconi B,Chiaravalli AM, Finzi G et al. (2012)Geneticheterogeneity in HER2 testing may influence therapy eligibility. Breast Cancer Res Treat 133, 161–168 (2012).https://doi.org/10.1007/s10549-011-1744-3

[4] Hanna WM, Ruschoff J, BilousMet al. (2014) HER2 in situ hybridizationin breast cancer: clinical implications of polysomy 17 and geneticheterogeneity. Mod Pathol, 27(1): 4–18.