人—乳腺组织细胞悬液制备流程

背景介绍

乳腺是乳房中的主要结构成分，以乳头为中心呈放射状分布于乳房组织中。乳腺属于外分泌腺，由腺泡和导管构成。乳腺的实质被结缔组织分隔成15~25个乳腺叶，每个乳腺叶又被分隔成若干个乳腺小叶，每个小叶为一个复管泡状腺。小叶间结缔组织内含有大量的脂肪细胞。

乳腺示意图

实验仪器及耗材

试剂配置

胶原酶溶液

• 100mg/mL 胶原酶I 用DMEM溶解为4mg/mL

10% FBS的DMEM

• 10% FBS+1% Antibiotic+DMEM

5% FBS的DMEM/Ham's F12

• 5% FBS+1% Antibiotic+DMEM

脱氧核酸核糖酶Ⅰ溶液

• 用PBS将脱氧核酸核糖酶Ⅰ溶解为1mg/mL

实验步骤

1. 将组织转移到15cm细胞培养皿中，用大量的PBS冲洗，以除去组织中残留的血液和储存的液体。吸去PBS，重复洗涤2次。总共清洗3次。

2. 使用锋利的手刀片将清洗后的组织切成2-3mm大小的碎片，在此过程中去取残留的脂肪组织，从而避免影响消化的效率。

3. 将约20mL的组织转移到50mL离心管中，加入20mL DMEM（含有5%FBS和4mg/mL胶原蛋白酶Ⅰ），将试管放在摇床上以180-200转的转速搅拌12-16小时，保持温度在37℃。

4. 搅拌结束后使用离心机，400g离心5分钟。去上清后使用50mL PBS洗涤，400g离心5分钟后去PBS。

5. 在离心后的类器官颗粒中加入2mL浓度为0.05%的胰酶，37℃静置消化6分钟，每2分钟取出试管上下摇晃一次，总计3次。

6. 加入含10mL 10%FBS的DMEM，400g离心5分钟，去上清，用1ml含10%FBS的DMEM重悬。

7. 加入100μL DNase，消化5分钟，加入10mL 10%FBS的DMEM，400g离心5分钟，去上清，用10ml含10%FBS的DMEM重悬。

8. 检测细胞活性，活性在85%以上可用于后续测序实验。

制备结果

注意：尽量选取新鲜样品进行操作，组织离体时间多长细胞容易死亡。影响最终的实验效果。