scRNA-seq揭示了正常和高脂饮食喂养小鼠升主动脉的细胞异质性

文章信息

题目：Single-cell transcriptome analysis reveals cellular heterogeneity in the ascending aortas of normal and high-fat diet-fed mice
日期：2021-09-21
期刊：Experimental & molecular medicine
链接：https://www.nature.com/articles/s12276-021-00671-2

摘要

升主动脉（Aorta ascendens）为主动脉与左心室交接的部分，始于第三肋间软骨下缘，并沿胸骨左半边上行。升主动脉有左冠状动脉和右冠状动脉两分支，供应心脏养分，之后主干会接至主动脉弓。

高脂肪饮食 (HFD) 是导致肥胖率高的重要因素之一，肥胖与胰岛素抵抗、高血压和血脂异常有关，会导致代谢综合征，这是心血管风险的标志。肥胖小鼠和人类的主动脉中脂肪组织体积增加，并且这种增加伴随着炎性细胞因子和氧化应激的增加。在不利条件下，主动脉僵硬度增加、斑块形成和血管功能障碍会导致主动脉疾病。

整个主动脉中的主要细胞类型是众所周知的，它们的异质性对于主动脉壁功能至关重要。但目前对健康和 HFD 主动脉中不同血管细胞的异质性知之甚少。本文使用 scRNA-seq 研究了健康和患病小鼠升主动脉壁内的细胞异质性和多种功能状态，帮助更好地了解 HFD 诱导的肥胖中主动脉疾病的病因和进展。

小鼠升主动脉壁的单细胞 RNA 测序分析

文章分析了来自正常饮食（ND）和HFD小鼠的24,001个升主动脉细胞，其中ND 小鼠得到14,663 个细胞， HFD 小鼠得到 9,338 个细胞，聚类得到27个细胞群，确定了10 种主要细胞类型。

• (i) 成纤维细胞（cluster 1-4），它们富含胶原蛋白和富含亮氨酸的小蛋白聚糖蛋白、1α1 型胶原蛋白 (Col1a1)、Col1a2 和核心蛋白聚糖；
• (ii) SMCs (Clusters 5-9), 高表达典型的 SMC 标记 Tagln、Myh11 和 Acta2；
• (iii) ECs (Clusters 10-12)，特征是 Pecam1、Cdh5 和 Cldn5 的表达；
• (iv) 以 Cd68、C1qb 和 Lyz2 的表达为标志的单核细胞和巨噬细胞（Mo/MΦ 细胞，Clusters 13-16）；
• (v) 间皮细胞 (Clusters 17 和 18)，高表达 Nkain4、Igfpb5 和 Cd248；
• (vi) 周细胞（ Clusters 19 和 20 ），高表达 Wif1、Chad 和 Sult1d1；
• (vii) T 细胞 (Cluster 21)，高表达 Cd3g、Cd3d 和 Nkg7；
• (viii) 树突状细胞 (DCs, Cluster 22)，高表达 Cd209a、H2-Ab1 和 H2-Eb1 ；
• (ix) 高表达 Kcan1、Plp1 和 Mly1 的神经细胞 (Clusters 23 和 24)；
• (x) B 细胞（clusters 25-27），高表达 Cd79a、Ly6d 和 Cd79b

从数量上看，成纤维细胞和 SMC 是最大的亚群。重要的是，HFD 主动脉中单核细胞和巨噬细胞的比例增加

ND和HFD小鼠升主动脉中 EC 亚群的比较

确定了 3个不同EC亚群（Cluster 10，EC_1；Cluster 11，EC_2；和 Cluster 12，EC_3）

在 ND 组中，EC_1 占 EC 人群的比例最大（49%），其他两个亚群占 51%（EC_2，28%；EC_3，23%）。值得注意的是，HFD 组 EC_1 显著增加，EC_2 和 EC_3 均减少 5%。

又看了每个亚群的marker基因：

• 最大的群体 (EC_1) 表达参与脂质转运 (Fapb4、Cd36 和 Gpihbp1)、细胞粘附 (Igfbp7 和 Cxcl12) 和血管生成标记 (Flt1) 的基因
• 第二个 EC 群体 (EC_2) 高表达 Vcam1 和 Pecam1与其他参与调节 EC 功能的基因 (Sfrp1、Clu 和 Gxylt2)
• EC_3 高表达 Mmrn1、淋巴管内皮透明质酸受体 1 (Lyve1) 和 Ccl21a，即淋巴管内皮的标志物

这三个亚群的差异基因也具有一些相似的功能：例如对创伤的反应、EC 增殖和血管发育的调节；同时也有各自特异的功能：EC_1对体液水平和止血的调节有反应，EC_2表达了几种调节细胞迁移和血管生成的基因，EC_3在白细胞迁移中表现出独特的富集。

为了进一步确定 HFD 对内皮亚群标志物的影响，接下来对 3 个 EC 进行了差异分析，并确定了 ND 和 HFD 组之间的差异表达基因。。值得注意的是，S100a8 是一种钙结合蛋白，在调节免疫反应和炎症过程中起重要作用，在 HFD 组中的EC_1 中上调。此外，HFD 中的EC_1高表达disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs 1 and Lyve。

ND 和 HFD 小鼠升主动脉中 SMC 亚群的比较

在 ND 和 HFD 小鼠的升主动脉中鉴定出五个 SMC 亚群，SMC_1、SMC_2 和 SMC_3 占 ND 组 SMC 种群的 95%，而 SMC_4 占 4%，SMC_5 仅占 1%。有趣的是，SMC_1 的比例从 ND 组的 43% 增加到 HFD 组的 64%，而 HFD 组中其他亚群的比例与 ND 组相比有不同程度的下降，表明SMC_1 具有特殊功能或来源。

尽管所有五个亚群都被认为是 SMC，但它们具有特异的表达特征。

• SMC_1表达与增殖和迁移相关的基因（Fn1、Ctgf、Eln和Tns1）

• SMC_2 显示收缩标志物（Acta2、Myl9、Myl6 和 Tagln）并表达低水平的细胞因子和胶原基因（Col4a2、Col6a1 和 Ccl4），还表达了与跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号通路有关的生物过程中富集的基因（Vim 和 Egr1）

• 尽管 SMC_3、SMC_4 和 SMC_5 表达 Tagln、Myh11 和 Acta2，但它们显示出与 SMC_1 和 SMC_2 不同的表达谱。SMC_3 高表达胶原蛋白和氧化还原基因（Col6a1、Col6a2、Gpx3 和 Colec11），并且表达细胞外基质组织反应基因（Vtn 和 Fbln1）。SMC_3表现出促炎特征，因此被称为炎症样SMC

• SMC_4 和 SMC_5 均高表达免疫相关基因，如 Cd79a、C1qa 和 Lyz2，以及迁移相关基因（Klf2 和 Ctss）

ND 和 HFD 小鼠升主动脉中单核细胞/巨噬细胞 (Mo/MΦ) 亚群的比较

在之前的聚类分析中，在 ND 和 HFD 小鼠的升主动脉细胞中鉴定了四个单核细胞/巨噬细胞簇（Mo/MΦ_1-4）。

在ND组中，82%的Mo/MΦ细胞对应于Mo/MΦ_1，其余三个群仅占细胞的18%（9%、6%和3%）。

虽然四个 Mo/MΦ 亚群表达了众所周知巨噬细胞标志物（Cd68、Cd14 和 Adgre1），但它们各自差异表达了多个基因：

• Pf4，第一个被描述的 CXC 类趋化因子，它是一种丰富的血小板蛋白24和 C1 补体基因（C1qa、C1ab 和 C1qc），在 Mo/MΦ_1 高表达
• Mo/MΦ_2 高表达细胞趋化基因，包括 Coro1a、Ccr2 和 Hmgb2，并表达参与核分裂的基因（Top2a 和 Stmn1）
• 在 Mo/MΦ_3 中，Col1a1（编码 I 型胶原蛋白）和 Sparc（调节细胞生长）高表达
• 最小的亚群 Mo/MΦ_4 高表达 B 细胞marker，包括 Cd79a、Ms4a1 和 Ly6d

在摄入HFD后升主动脉的所有巨噬细胞簇中观察到Mo/MΦ_2细胞比例增加，Mo/MΦ_1、Mo/MΦ_3和Mo/MΦ_4细胞比例降低。

同样看差异基因的富集通路，Mo/MΦ_1 和 Mo/MΦ_2 都显示出白细胞迁移和白细胞趋化性的富集，表明细胞活化、募集和免疫细胞相互作用有驱动作用。Mo/MΦ_3 富含细胞外基质组织，在摄入 HFD 期间，Mo/MΦ_3 中趋化因子和受体（包括 Ackr3、Ccl11、Ccl19、Ccl7、Cxcl12 和 Cxcl16）的表达增强。Mo/MΦ4对应于淋巴细胞分化和B细胞活化，高表达包括Ly6d、Ltb和Cd79a（B细胞的已知标志物）。

细胞通讯分析

为了预测细胞间通讯，研究了细胞类型之间潜在的配体-受体相互作用，发现巨噬细胞、EC 和 SMC 的相互作用数量增加了。在 12 个细胞亚群中检测到 30 种信号通路，包括 TGFβ、BMP、PDGF、VEGF、CXCL、CCL、IL2 和 MIF 通路。有趣的是，EC_2是一个重要的介质，扮演着细胞间通讯的看门人的角色。

CXCL 相互作用的主要模式是 HFD 喂养的主动脉细胞中的旁分泌信号传导，只有一个 EC 群（EC_2）和一个巨噬细胞群（Mo/MΦ_3）显示出明显的自分泌信号。

另外，在所有配体-受体对中，主动脉 CXCL 信号由 Cxcl12 配体及其受体 Ackr3 主导。

与 CXCL 信号网络相比，作者对 CCL 信号网络的分析看到了一个主要区别：仅仅是一个简单的结构，只有一个受体 (Ccr2) 和一个巨噬细胞群 (Mo/MΦ_2)，显示出巨噬细胞对巨噬细胞更大程度的信号传导和较弱的 EC 到巨噬细胞和 SMC 到巨噬细胞信号传导。