文章题目：Single-cell multi-omics reveals dyssynchrony of the innate and adaptive immune system in progressive COVID-19
日期：2022年1月21日
期刊：NATURE COMMUNICATIONS
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-021-27716-4
SARS-CoV-2病毒的免疫反应失调是COVID-19重症的原因。然而，与免疫病理相关的免疫信号知之甚少。在这里，该项研究使用多组学单细胞分析来探讨COVID-19稳定或进展期住院患者的动态免疫反应和探索V(D)J库，并评估托珠单抗的细胞效应。基因表达和细胞系蛋白标记的协调分析显示，S100Ahi/HLA-DRlo经典的单核细胞和激活的LAG-3T细胞是进展性疾病的标志，并分别强调了骨系细胞和T细胞上MHC-II/LAG-3的异常相互作用。该项研究还发现，在扩大的效应细胞CD8+ 克隆、未突变的IGHG+ B细胞克隆和具有稳定体细胞超突变频率的突变B细胞克隆中，T细胞受体储备出现倾斜。总之，该项研究深入的免疫分析揭示了在进展期COVID-19中先天和适应性免疫相互作用的非同步性。
数据已存入GEO数据库，号码为GSE155224。可以通过COVID-19细胞图谱数据挖掘网站(www.covidcellatlas.com[1])进一步研究这些结果。这个用户友好的网站有一个图形用户界面，可以快速可视化scRNA-seq数据，用户可以探索所有细胞类型中单个基因或感兴趣的基因集的表达水平，比较COVID-19与对照组、进展期与稳定期患者，数据集中所有免疫细胞的早期和晚期时间点。
在当前的研究中，该项研究试图更深入地了解COVID-19患者在疾病严重程度和疾病病程中的免疫反应。为此，采用单细胞方法研究了10名患者在不同时间点的18份PBMC样本。使用年龄和性别匹配的健康受试者(n=13)作为对照。采用基于液滴的单细胞平台(10x Chromium)进行单细胞RNA测序，以构建5’基因表达文库、表面蛋白文库(CITE-seq)、T细胞受体(TCR)文库和B细胞受体(BCR)文库。过滤和清理后153,554个细胞被纳入scRNA-seq分析。此外，也获得所有患者的临床和实验室信息，包括病毒载量和细胞因子组。
样本来自稳定和进展中的COVID-19患者，是耶鲁大学COVID-19 IMPACT(实施针对冠状病毒的医疗和公共卫生行动)生物库的一部分。曾在ICU接受治疗并最终死亡的危重患者(n=4)定义为病情进展患者，病情稳定的重症患者(n=6)在内科病房住院并最终康复出院。该项研究分析了每个患者两份不同血液样本的PBMCs，早期(A)和晚期(B)时间点，除了两个进展期患者(TP8, TP9)，他们只有一个样本。根据临床参数，80%的受试者接受了托珠单抗治疗。分别取A时间点和B时间点处理前和处理后的样品。对照组和COVID-19患者的基线特征相似，包括年龄和性别，而欧洲血统的个体在对照组中更普遍。进展期患者与稳定组在基线特征、共病和时间线方面没有差异。进展期患者的改良SOFA评分(一种进展期严重程度评分)明显更高。
在两个时间点，在对照、稳定和进展样品中检测到特定细胞类型的相对丰度的一些差异。进展期患者初发T细胞(CD4+ 和CD8+ )相对减少，浆母细胞和分裂T 和NK细胞在COVID-19患者与对照组的对比增加。干扰素(IFN)激活的CD8+ T细胞簇是一个由191个细胞组成的簇，其特征是IFN刺激基因(ISGs)的高表达，几乎只在COVID-19患者中发现，特别是在时间点A中。
经典的单核细胞群亚聚成两个不同的群体：一个是HLA-DR低表达的群体，这是一种主要组织相容性复合体(MHC) II类分子，后被称为S100Ahi/HLA-DRlo单核细胞。与对照组相比，COVID-19患者的S100Ahi/HLA-DRlo群集比例较高，这与之前的研究一致。另一方面，非经典单核细胞(标记物FCGR3A)在COVID-19中减少，这也与最近的研究一致。COVID-19患者的髓样树突状细胞(DC)也减少。总之，对稳定和进展期COVID-19患者在不同时间点的PBMCs进行了全面的图谱，捕获了特定细胞类型相对丰度的动态变化，反映了免疫系统对病毒的反应
进一步分析了每种细胞类型的基因表达变化以及疾病随时间进程的变化。COVID-19中所有细胞类型的I型干扰素(IFN-I)反应均升高，尤其是在时间点A，在进展期受试者中更是如此。所以在样本水平上，IFN-I评分与同期病毒载量之间存在很强的相关性，与健康对照组相比，COVID-19患者中所有主要细胞类型的常规ISGs，如IFI6、IFI44L、LY6E和ISG15显著增加。双调节蛋白(AREG)是表皮生长因子受体(EGFR)的一种配体，不是人类的主要ISG，在健康对照PBMCs中几乎检测不到，但在COVID-19患者的单核细胞、T细胞、NK细胞和DCs显著增加。尽管AREG是在伤口修复和炎症解决方面扮演重要角色，但是据报道，它的表达也在肺部的病毒感染中增加并会在SARS-CoV感染的小鼠模型中诱导严重的肺病。IFN-I信号通路在小鼠骨髓细胞AREG诱导中起重要作用。最近一份报告显示，COVID-19患者外周血单核细胞中AREG增加，支持AREG在SARS-CoV-2诱导的肺病理中可能发挥的作用。
COVID-19疾病的时间进程以许多基因的转移和配体受体相互作用为特征。正如预期的那样，所有患者和所有细胞类型的IFN-I评分从时间点A(更早抽血)到时间点B(更晚抽血)显著下降，与这些时间点之间的病毒载量下降相对应。值得注意的是，在A和B时间点IFN-I得分的下降与它们之间的时间差异有很强的相关性。这些发现表明在大多数患者中，最初升高的IFN-I反应随着时间的推移和病毒载量的减少而下降。有趣的是，在一些进展性患者中，IFN-I反应似乎持续存在，与病毒清除降低相一致。
该项研究观察到，在所有细胞系中，稳定和进展患者之间存在显著的基因表达差异。在进展患者中，ISGs的表达在所有细胞类型中都增加并且骨髓细胞和其他几种细胞类型的抑制性细胞因子IL10表达也出现增加。据该项研究最近的研究以及其他研究报道，血浆中IL-10水平在严重的COVID-19中升高，并且IFN-I可诱导IL-10表达，从而在某些条件下限制免疫相关组织损伤。与ISGs相似，血浆IL-10水平从时间点A下降到时间点B，尽管在更大的队列患者中，这种下降只出现在稳定的非ICU患者中，而在ICU患者中IL-10水平保持较高。该项研究观察到PBMCs中IFN-I评分与血浆IL-10水平之间存在中度正相关，这可能支持在COVID-19患者中观察到的IFN-I反应强度与IL-10抑制反应之间的相关性。此外，该项研究观察到与稳定期患者者相比，进展期受试者的抗原提呈细胞(APCs)中MHC-II转录本降低，后者更类似于对照受试者。众所周知，IL-10的增加会下调MHC-II、这可能解释了进展期受患者的下降。总之，在进展期患者中，IL-10增加和MHC-II减少的抑制信号可能是一把双刃剑:一方面，减少炎症和保护组织免受免疫相关损伤，另一方面，阻碍有效抗病毒反应的能力。
为了更好地理解稳定型和进展期COVID-19单核细胞之间的转录差异，该项研究在排除对照组细胞后对其进行亚聚类。在7个簇中产生23,701个单核细胞。该项研究在稳定和进展期的病人细胞中确定了一个清晰的分界, 这部分是由进展期患者中ISGs的表达增加所驱动的, 调节和组织修复相关基因在进展期单核细胞与稳定期单核细胞中增加，包括CD163、IL1R2、AREG、共抑制受体HAVCR2(编码TIM-3)及其配体LGALS9(编码Galectin-9)和IL10。在进展期患者中，编码具有抗病毒活性(主要针对单链RNA病毒)的RNASE2蛋白的表达也增加了。值得注意的是,LGALS9表达增加不仅在髓细胞还在B细胞和进展期患者的CD4+T细胞, 这表明TIM-3/Gal-9通路在髓系细胞/T细胞相互作用中具有潜在的作用，可以增强进展期患者髓系细胞的调节表型，如在癌症患者中观察到的。
如图所示，进展期单核细胞中MHC-II分子减少。警报素S100A8/S100A9在进展期单核细胞与稳定期单核细胞中的DEGs中排名最高。值得注意的是，S100A8/9的表达也受托珠单抗治疗的影响。由于S100A9是骨髓源性抑制细胞(MDSCs)的标记物，并能促进IL-10的生成和MDSCs的抑制能力，进展期患者的单核细胞特征与MDSCs有些类似。事实上，两个经典单核细胞簇中的一个富含MHC-II低表达的MDSCs相关基因(S100A8,S100A9,IL1R2, IL10)。此外，该单核细胞簇显示出与最近发现的严重败血症单核细胞群高度重叠的转录特征。出乎意料的是，与对照组相比，在进展期和稳定期患者中，促炎单核细胞标志物IL1B和TNF在COVID-19单核细胞中均下调，尽管在稳定期患者中IL1B的下调略低。这一观察结果与最近报道的COVID-19严重呼吸衰竭患者的免疫抑制表型一致
综上所述，这些发现揭示了进展期患者单核细胞的扭曲调控特征，类似于免疫瘫痪。鉴于这些与免疫抑制表型相关的基因中有许多是受IFN-I信号下游调控的(AREG, IL1R2, S100A8,S100A9,IL10)，这种经典单核细胞向MDSC样抑制细胞的转变可能源于强烈的IFN-I反应。此外，该项研究的连接体分析强调了增强的TIM-3/Gal-9环路，这可能有助于异常的调控髓系特征。这种过早地转向缓解期可能会中断适当的抗病毒免疫反应，导致病毒清除延迟和在严重COVID-19中观察到的有害临床表现。
接下来，该项研究尝试检测不同疾病条件下CD8+ T细胞亚群的基因表达差异。详细分析子集19458个CD8+ T细胞显示在稳定型和进展期患者之间有明显的区分, 这主要是由于进展期患者中ISGs 的高表达, 也可以通过效应细胞因子如GZMB的高表达来显示。大多数来自IFN激活的CD8+ T细胞簇的细胞位于进展期部分，并与效应T细胞簇重叠。基因表达谱从早期时间点A到晚期时间点B有明显的变化，主要是由ISG信号的减少驱动的。后续研究表明共抑制受体LAG3在进展患者的T淋巴细胞中表达增加，而其配体(MHC-II分子)在抗原提呈细胞中表达减少。
10名COVID-19患者中有8名接受了抗IL-6受体(IL-6R)抗体托珠单抗治疗。该项研究进一步研究了与托珠单抗治疗相关的差异基因表达模式。IL6R在单核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、CD4+ T细胞(包括FoxP3调节性T细胞(Tregs))和原始CD8+ T细胞中高表达。另一方面，IL6R在其他类型的淋巴细胞中表达较低，包括记忆性CD8+、效应性CD4+和CD8+ T细胞，gamma-delta T细胞，B细胞和NK细胞。IL6ST(编码gp130)负责IL-6与IL-6R结合后的信号转导，在所有类型的PBMCs中都有表达。为了确定托珠单抗治疗对COVID-19患者的转录效应，该项研究比较了托珠单抗治疗组与未接受托珠单抗治疗组患者从A到B时间点的基因表达变化。该项研究重点研究了6个与IL-6通路相关的托珠单抗应答基因(ARID5A, BCL3, PIM1, SOCS3, BATF, MYC)，已知它们在类风湿性关节炎患者中会被托珠单抗干扰。值得注意的是，托珠单抗的这些转录变化主要在高表达IL6R和IL6ST的细胞类型中观察到，如初始CD4+ T细胞、记忆CD4+ T细胞、初始CD8+ T细胞和调节细胞。为了量化这一效应，该项研究进行了IL-6评分(上述6种托珠单抗应答基因的综合评分)。该项研究发现，所有接受托珠单抗治疗的患者CD4+ T细胞中IL-6评分显著下降，而未接受托珠单抗治疗的患者没有下降。
接下来，该项研究试图识别在COVID-19患者中被托珠单抗干扰的其他基因。为了尽可能减少疾病相关基因表达随时间变化的混杂效应，该项研究重点研究了非托珠单抗组中基因表达没有随时间变化而下降，但在托珠单抗治疗后显著下降的基因。该项研究证明，在大多数细胞类型中，托珠单抗治疗后S100A8和S100A9的表达高度下调，但在非托珠单抗组中未发生变化，甚至略有升高。鉴于S100A8/9和IL-6之间存在一个正向前馈回路，可以驱动促炎症通路，血清S100A8/9升高是COVID-19重症患者的标志之一，托珠单抗可能通过抑制COVID-19中S100A8/9的表达来发挥作用。有趣的是，IL6R在髓系细胞中的表达高于IL6ST，而在其他所有细胞类型中的表达都低，导致IL6R/IL6ST比值的差异。根据最近的一项研究，这个比例决定了对IL-6信号的反应类型，在具有高IL6R/IL6ST的细胞中抗炎经典信号(在该项研究的髓细胞中观察到)或在低IL6R/IL6ST的细胞中促炎反式信号(非髓系细胞)，可能解释了观察到的细胞类型对托珠单抗反应的差异。虽然该项研究在细胞水平上检测到对托珠单抗的反应，但该项研究的研究既不是设计的，也不是为了检测治疗的任何临床效果。尽管如此，这些基因表达模式可能表明COVID-19患者中托珠单抗效应、IL6R、IL6ST和S100A8/9之间存在关联。
接下来，该项研究使用CITE-seq构建了一个独立的PBMCs免疫表型图谱。为了更好地识别细胞多联体，使该项研究能够将细胞超负载到10X平台上，该项研究使用细胞哈希技术，在每个10X反应中复用5-6个样品。该项研究采用189个寡核苷酸标记的抗体。从下游分析中去除样本来源不明的多片段和细胞，83.2%的细胞进行分析(n=43,349)在无监督聚类之后，通过使用手工管理的标记基因列表，对CITE-seq细胞进行基因表达和抗体来源计数(ADT)注释。该项研究观察到一组未确定的细胞(n= 8032)，它们的ADT信号的多个谱系标记呈阳性，并且/或显示出不太可能用免疫学证据解释的信号升高 。这些细胞从分析中移除，所有其他细胞绘制在UMAP空间上。为了研究两种注释的一致性，该项研究计算了RNA注释和ADT注释的细胞类型之间共享细胞的百分比。
重叠的细胞类型中,该项研究发现49%的ADT注释激活效应T细胞集群(HLA-DR+CD38+)与GEX重叠划分T/NK集群, HLADRA / CD38和MKI67标志着独特的T细胞在COVID-19亚群。HLA-DR和CD38的双重表达或Ki67的高表达被认为是急性病毒感染中高度活化的T细胞群的标志。该项研究观察到在COVID-19患者中，GEX分裂T/NK集群中表达MKI67的TCR+ T细胞增加，这一结果通过流式细胞术在相同样本和不同队列中进一步验证，特别是在进展期患者的CD4+ T细胞中.最近一项对大量COVID-19患者使用流式细胞术的研究支持了这一观察结果。
CITE-seq技术进一步使该项研究能够阐明这些活化的T细胞群的转录特征。与其他T细胞簇相比，HLA-DR+CD38+ T表达共抑制受体(LAG3、CTLA4、PDCD1、ENTPD1、HAVCR2)，初始/干细胞标志物(TCF7、LEF1)和细胞毒性T细胞标志物(NKG7、KLRG1、PRF1、GZMH)表达较低。促进T细胞衰竭的转录因子(TFs) (PRDM1, MAF)也在该集群中富集。这些数据表明，在这一簇的T细胞显示扭曲的转录标志向终末分化。
接下来，该项研究确定了这种活化的T细胞簇在稳定期和进展期COVID-19患者之间是否存在转录差异。进展期患者IFN-I应答基因(MX1, IRF7, ISG20)和细胞毒性/促炎细胞因子(PRF1, GZMH, IFNG)表达较高，干细胞/祖细胞标志物(TCF7, LEF1)表达较低。有趣的是，大多数共抑制受体在进展期患者(LAG3, CTLA4, HAVCR2)中富集，一些在稳定期患者中富集(PDCD1, TIGIT)。衰竭/效应驱动TFs (PRDM1, MAF)和在衰竭T细胞中表达的免疫调节细胞因子IL10在进展性患者中上调。该项研究发现，在进展期COVID-19患者激活的T细胞中，LAG-3是上调最多的共抑制受体，这一结果通过流式细胞术对不同队列的COVID-19患者进行了验证。考虑到共同抑制受体的高表达标志着T细胞耗竭和最近的研究表明在COVID-19的T细胞中观察到类似衰竭的基因表达模式，该项研究试图通过基因集富集分析(GSEA)来确定这些分裂的T细胞在进展患者中的基因表达特征。与稳定期患者相比，进展期患者的T细胞分裂表现出更多的终末耗竭T细胞信号和IFN-I反应信号。进展期COVID-19患者的转录特征与进展期与对照的HIV特异性T细胞的转录特征重叠。尽管在病毒感染的急性阶段观察T细胞衰竭还为时过早，但考虑到IFN-I通路在肿瘤浸润T细胞和慢性病毒感染中都促进了T细胞衰竭，该项研究的数据表明，进展期COVID-19患者更强或更长时间的IFN-I反应可能会促进T细胞提前分化。
据这些观察，该项研究进一步试图了解稳定和进展患者之间免疫细胞相互作用的变化。在LAG-3配体中，该项研究观察到进展期COVID-19患者骨髓细胞和B细胞上的MHC-II分子显著减少，这也在该项研究对进展期与稳定期COVID-19患者的差异分析中得到了证实。流式细胞术分析显示CD4+ T细胞上的LAG-3与CD14+ 经典单核细胞上的HLA-DR呈负相关，提示LAG-3/MHC-II相互作用的改变可能在疾病进展中发挥作用。
总之，该项研究的scRNA-seq分析和流式细胞术验证显示在COVID-19患者中，激活的T细胞数量增加，LAG-3的表达更高。此外，对这一人群的转录分析显示，在进展期COVID-19患者中共抑制受体表达较高，并且出现了一个终分化的T细胞样特征。T细胞和抗原提呈细胞之间不平衡的LAG-3/MHC-II相互作用可能反映了固有适应性细胞相互作用的失败，导致细胞毒性细胞因子的异常表达，进而可能导致免疫病理的变化。
为了鉴定与SARS-CoV-2免疫相关的T细胞受体(TCR)，该项研究对COVID-19和对照样本进行了单细胞V(D)J分析。总共捕获67393个细胞的TCR数据，每个样本的中位数为1954个细胞。数据质量评估和控制过滤出8303个细胞，每个样本中位数为1778个细胞。基于这些高质量的数据，来自同一受试者的具有相同的β和α链V(D)J序列的细胞被分组为克隆。总共有41,742个唯一克隆被鉴定，平均每个样本有1297个克隆。
使用Alakazam R包计算记忆CD4+ T细胞和初始CD4+ T细胞以及记忆和初始CD8+ T细胞的Alpha多样性和稀疏性。进展期患者的记忆和初始CD8+ T细胞在两个时间点的多样性均低于稳定期患者，这与进展期患者CD8+ T细胞克隆扩增较高是一致的。这种alpha多样性的差异在记忆和初始CD4+ T细胞中没有观察到。进展期和稳定期患者在A、B时间点CD4+ 和CD8+ T细胞克隆丰富度和均匀度的变化无明显差异，可能是进展期患者在两个时间点均有数据的数量较少所致。
为了识别可能赋予SARS-CoV-2特异性的TCR区域特征，该项研究使用GLIPH2评估COVID-19患者的互补决定区3(CDR3)序列的相似性。该项研究专门在β链中寻找CDR3基序，这些基序在几个COVID-19患者中共享，但在13名对照组中没有。严格的过滤器应用于GLIPH2 CDR3特异性组(或簇)以提高准确性，特异性组有大于3个独特的TCR，显著的 V-gene 偏倚(p<0.05)。筛选的特异性组与对照样本的任何克隆都被过滤掉，以增强对SARS-CoV-2的特异性，而不是对巨细胞病毒等其他常见病毒的特异性。经重度过滤后，CD8+ 和CD4+ T细胞分别为24组和172组。大多数鉴定的特异性组包括来自不同样品的克隆，表明潜在的SARS-CoV-2特异性克隆的CDR3序列有很大的相似性。为了进一步增强对克隆扩增的SARS-CoV-2应答T细胞的特异性，该项研究重点研究了来自3名受试者的10个CD8+ 和12个CD4+ T细胞组，其中至少有一个克隆含有2个细胞。使用V和J基因分析显示强大的J基因偏误在3个CD8+ 组和1个CD4+ 组。一些VJ组合显示主要使用如TRAV5/TRAJ12 /TRBJ2-7/TRBV5-6对簇1的使用占主导地位。CD4+ T组V基因使用无明显偏倚，J基因使用以TRBJ2-5为主
在10个和12个假定的SARS-CoV-2特异性和扩展组中，该项研究进一步选择了来自大于等于3个不同COVID-19患者的克隆，其中大于等于55%的克隆具有一个以上的细胞，从而分别形成5组和2组CD8+ 和CD4+ T细胞。选择的集群也是前5和前2克隆集群，GLIPH2的组成分数最好，它衡量了基于全球/局部相似性的特异性组的强度，常见V基因的富集，有限的CDR3长度分布，扩展克隆(ECs)和集群大小。这表明所选择的特异性组可能来自SARS-CoV-2特异性ECs，并在COVID-19患者中共享，具有高度保守的CDR3氨基酸(AA)序列。所有特异性组都是基于CDR3区域的全局相似性来确定的，除了CD8+ T细胞中的cluster IV，其成员克隆具有不同的CDR3长度，但具有相同的模体QDIG。具有全局相似性的特异性组的CDR3序列基序。该项研究证实了该项研究的样本不受HLA基因型的影响。CDR3基序与最近两项采用TCR表数据的SARS-CoV-2研究中发现的CDR3基序进行了比较，这些研究主要收集的样本来自于SARS-CoV-2的恢复期和恢复期患者。结果显示，该项研究的CD8+ 特异性组V motif (TNTGE)与Schultheiß等发现的TGTGE motif (TGTGE)具有相似的模式。该研究没有在SARS-CoV-2康复患者共享的前31个模体中发现该模体，但发现在疾病活动性期间以及从一名轻度疾病患者和康复患者的恢复过程中，该模体在纵向样本中共享，这表明该模体对SARS-CoV-2具有特异性。这种重叠验证了该项研究的CD8+ 组 V模体对SARS-CoV-2感染的特异性。在活跃性疾病期间的样本采集和排除对照样本中存在的特异性组的GLIPH2分析也证明了该项研究的TCR分析的重要性。
每个样本的细胞数、每种B细胞类型(初始B细胞、记忆B细胞、浆细胞)的频率、每种同型(IGHM/D/G/A)的频率分别汇总。总的来说单细胞V(D)J文库包含7177个细胞，分布在18个样品中。
COVID-19患者的IGHV/IGHJ突变频率和CDR-H3长度因抗体类型和细胞类型不同而不同。IGHM记忆细胞和血浆B细胞的突变频率显著低于5%，无论治疗或疾病进展组。正如所料，IGHG记忆B细胞和浆细胞的突变频率高于IGHM细胞。特别是稳定且未接受治疗的COVID-19患者浆细胞突变频率明显高于5%。稳定患者在托珠单抗治疗下的记忆细胞有更高的突变频率。
IGHG和IGHM的B细胞的CDR-H3长度一般在10到20 AAs之间变化(该项研究使用15 AAs作为下游比较)。然而,IGHG浆细胞的CDR-H3长度在COVID-19稳定患者中明显大于15AAs;而IGHG记忆细胞的CDR-H3长度与15个AAs没有显著差异。平均而言，稳定的非托珠单抗患者的IGHG浆细胞CDR-H3长度大于稳定的托珠单抗治疗患者。
该项研究试图调查两个抽血时间点(A和B) CDR-H3 AA使用的差异。该项研究通过计算CDR-H3段中每个AA在时间点B相对于时间点A的条件信息内容(IC)来处理这个问题。该项研究平均了三个不同组患者的ICs条件:(1)未接受治疗的稳定患者;(2)托珠单抗治疗的进展型患者(托珠单抗-进展型);(3)托珠单抗治疗下病情稳定的患者(托珠单抗-稳定型)。研究的结果表明，AA在托珠单抗-稳定型患者中的使用情况与其他组相当不同。事实上，托珠单抗-稳定型患者的IGH指标在各时间点之间对CDR-H3段特异性AAs使用的偏好没有任何变化。相反，进展期和非稳定期患者的IC分布在不同的AAs中是不同的。特别是，相对于A，进展期和不稳定期的患者在B时点丙氨酸(A)、天冬氨酸(D)和酪氨酸(Y)的使用量增加，脯氨酸(P)、谷氨酰胺(Q)和苏氨酸(T)的使用量减少。
为了探究COVID-19患者的抗原驱动B细胞应答，该项研究研究了扩展克隆谱系。该项研究鉴定了20个扩展克隆(ECs)，采用了来自15/18的样本，包含1157/7177个细胞(占所有B细胞的16%)。在ECs中浆细胞显著富集。TP7A和TP7B样品不含浆细胞。在托珠单抗-稳定型患者的ECs中，在托珠单抗-稳定型的ECs中，IGHG细胞显著富集，在托珠单抗-进展型的ECs中，IGHM细胞显著富集
该项研究进一步研究了ECs内细胞的突变频率和CDR-H3长度。该项研究观察到，无论治疗状态如何，稳定患者的IGHG浆细胞的突变频率平均高于进展患者。稳定患者IGHG浆细胞的CDR-H3长度明显大于15个AAs。特别是，未接受治疗的患者比接受治疗的患者有更大的平均CDR-H3长度。进展期患者IGHG浆细胞的CDR-H3长度明显短于15个AAs。
在其他抗病毒反应中已观察到针对特定抗原选择特定IGHV基因，例如针对某些流感病毒抗原选择IGHV1-69基因。因此，该项研究试图在COVID-19患者中筛选IGHV基因。IGHV4-34基因在稳定患者的ECs中使用较多，治疗组的优势比为~10，未治疗组的优势比为~9.5。进展期患者使用IGHV4-34较低，优势比为~5.9。该项研究进一步对扩展的B细胞克隆进行了IGHV基因使用的主成分分析(PCA)。该项研究已经确定了一组正在治疗的患者，包括稳定和进展的患者，其对应的ECs只包含IGHV1-46(100%在TS4B)， IGHV3-21(100%在TS2B)， IGHV3-30-3(85%在TS3A)和IGHV3-72(100%在TP6A)。
BCR序列分析可以为研究COVID-19内B细胞的反应动力学提供重要信息。先前的工作证明与健康对照组相比，COVID-19患者中未突变的IGHG B细胞克隆比例更高。这可能是初级免疫反应中GC进入前早期类切换的迹象。该项研究同样观察到，考虑到扩增克隆和未扩增克隆，每个患者中有0% - 45.7%的IGHG克隆未突变。此外，与进展期患者相比，稳定期患者未突变的IGHG克隆比例更高，尽管这种差异不显著。最近的一项分析表明，这种未突变的胞浆细胞的扩增是住院的COVID-19患者的特征，而不是有轻微症状的患者。这些克隆主要由记忆细胞和浆细胞组成，而IGHM克隆主要由IGHM细胞组成。该项研究还观察到多个不同的B细胞克隆，包括扩展的和非扩展的，跨越两个时间点。为了描述这些克隆的潜在亲和性，该项研究为所有克隆建立了至少包含三个序列的B细胞系统发育树，这些序列要么是不同的，要么是在不同的时间点发现的。该项研究在时间点A观察到这些克隆中SHM水平相对较高。然后，该项研究使用系统发育的根尖相关检验来确定这20个克隆从种系序列的差异是否在A和B时间点之间增加。样本时间与序列共同祖先的差异无显著正相关。这些结果表明，在这些克隆中缺乏可测量的时间点SHM积累。综上所述，观察到的未突变的浆细胞的扩张和可测量的B细胞进化的缺乏与之前的研究一致，可作为COVID-19住院患者中生发中心反应中断的证据。
该项研究在8名患者中发现了19个聚集性抗体簇。79%(15/19)的聚集性簇包括来自托珠单抗-稳定型患者的抗体，47%(9/19)包括来自非托珠单抗稳定患者的抗体，31%(6/19)的聚集性簇包括来自托珠单抗-进展型患者的抗体。接下来，该项研究将重点放在托珠单抗-稳定型的患者身上，这些患者在最集中的群体中有代表性。该项研究确定了6个聚集性簇，仅由托珠单抗-稳定型患者组成。这些抗体聚集在两名患者之间，由IGHV1-46/IGHJ3、IGHV3-23/IGHJ6、IGHV3-33/IGHJ6、IGHV3-48/IGHJ3、IGHV4-59/IGHJ6、IGHV5-51/IGHJ4基因组成。
总之，该项研究的多组学单细胞分析显示，在托珠单抗治疗下，COVID-19表现稳定和进展的患者发生了动态免疫反应。该项研究全面的免疫分析强调了COVID-19中巨大的IFN-I反应以及非同步的适应性和先天免疫相互作用。基因表达和表面蛋白联合分析揭示了进展患者中活化T细胞亚群的超IFN-I反应。在活化的T细胞中，过度的调节性固有免疫反应和独特的共抑制受体表达是疾病进展的标志。在COVID-19患者中发现了CD8+ T细胞的倾斜T细胞库和独特的富集VDJ序列。在SARS-CoV-2感染急性期，没有获得体细胞高突变的浆细胞扩增与早期原发性和/或滤泡外反应相一致。最后，该项研究描述了对托珠单抗的细胞反应，包括大多数细胞类型中托珠单抗治疗患者中S100A8/9的表达下降。
该项研究的实验设计使该项研究能够确定:
该项研究的无偏系统生物学方法利用新的多模态单细胞分析技术揭示了这种疾病的免疫反应的时间动力学。它突出了区分稳定型和进展型COVID-19患者的独特免疫特征。该研究中的免疫网络特征，提高了对在严重疾病中促进病理的丰富的细胞相互作用和影响的理解，包括先天免疫和适应性免疫反应的非同步化。
总的来说，该项研究全面的免疫分析强调了在进展期COVID-19中先天性和适应性免疫相互作用的不同步，这可能导致病毒清除的延迟。对严重COVID-19免疫细胞图谱的高分辨率理解将增强该项研究开发免疫调节治疗方法的能力，以防止COVID-19患者病情进一步进展。
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