甲基化思路



课前的话

👍

1.本次课程是甲基化专题，出发点是联合甲基化和转录组进行生信分析，课程可能会讲到很多大家都没怎么听说过了解过包，但是在甲基化相关分析中很实用

2.课程的设计是针对小白零基础，所以前几天可能会有很多常识性内容，会的小伙伴前面稍微耐心一些，后面会有些不一样的内容

3.咱们上课按照课程大纲走，边走边看，如果有跟不上的情况，到时候我们再调整课程进度，另外如果有特别想学习的甲基化相关分析技能，可以跟我提，我觉得合适的也会作为了课程的一部分

4.大家可以根据自己的兴趣爱好进行分组找队友，在腾讯文档里面没有写的，你可以当队长，相当于发布英雄贴，在上课期间有同学跟你一组，那你们在课程中就可以一起学习讨论，甚至设计文章思路，答疑的时候就可以开始分析了。我建议每个组的人数不要超过5个人，太多人了导致低效率划水以及名字不好带（说话有点直接哈）

5.大家先不加我私聊，上课期间私聊我很费精力，这期间我的主要精力就是在群里，不希望被分散，有问题就先发群里，我会回答的。等上完课，大家如果有思路或者文章方面的问题，可以私聊我。

6.关于同学们自己研究的疾病本身的病理机制和观点等，可能我还没有你们了解深刻，但是对于怎么结合生信分析，如何进一步分析，可以一起交流探讨

一、甲基化芯片背景知识

1.甲基化的生物学意义，

概念

📌

概念：甲基化是在甲基转移酶的催化下胞嘧啶（C）第五个碳原子添加一个甲基基团形成，通常DNA甲基化发生在CpG位点，但非CpG位点同样发生甲基化。甲基化水平可以分为高甲基化、低甲基化和去甲基化。由于甲基化是疏水基团，DNA高甲基化能够影响DNA结构，从而影响基因的转录。

功能

（1）基因表达调控 在启动子区域的胞嘧啶甲基化通常能够降低基因表达。88％的活跃的启动子通常是去甲基化的。（羟甲基化与基因表达升高相关）

（2）染色质的结构 高甲基化能够导致异染色质形成。如果异染色质中的高甲基化位点出现异常的低甲基化，则与染色体不稳定相关。比如选择行X染色体的失活。

（3）细胞分化 甲基化水平改变通常能够导致细胞向一个方向进行分化，所以分化后的细胞通常不能再逆转为干细胞。

（4）疾病的发生　咱们上述的三种方式都能够导致对吧

📌

CpG岛：具有超过55%的GC含量，长度大于500bp的片段。40%的启动子区域都包含CpG岛，简单来说就是CpG位点很多的片段

C是胞嘧啶，G鸟嘌呤，p是磷酸基团，CpG岛就是CpG含量比较高的片段

📌

CpG island 是很多有CpG位点的核苷酸

📌

CpG shore：距离CpG岛2kb区间内的片段。超过75%的组织特异性甲基化区间都在shore部位，shore区间的甲基化与基因表达具有强相关性。

📌

增强子：是一段能够促进远端的靶基因转录的作用元件，通常由甲基化调控，有研究表明增强子能够整合转录因子结合的平台。我们之后有相关的分析工具进行这方面调控关系的探索，比如ELMER

📌

启动子：与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列。我们生信分析时，一般选择上游2 kb，但也有选择上下游2kb的。获取启动子序列时要注意转录方向（正链或负链）

2.目前甲基化芯片或测序的对比

不同甲基化分析技术比较.pdf

WGBS-Seq：

原理是用亚硫酸盐处理DNA序列，首先将基因组中未发生甲基化的 C 碱基转换成 U（T），从而与原本具有甲基化修饰的碱基C区分开来，然后进行PCR扩增，再结合高通量测序技术，适用于全基因组范围内绘制单碱基分辨率的DNA 甲基化图谱，适用于所有物种，能够检测所有基因以及人类中包含3800万个CpGs位点（目前能检测的范围最广）。但是价格昂贵，目前应用也很少。

RRBS-Seq 

（Reduced Representation Bisulfite Sequencing） 限制性内切酶对基因组DNA序列进行酶切，然后富集启动子及CpG岛区域，接着再进行亚硫酸盐进行转化，从而用较小的数据量就可得到包含最多CpG位点的单碱基水平的甲基化图谱。检测深度只包含50%的promoters，但是价格和methylation microarray差不多，所以应用的比较少

MeDIP 

（Methylated DNA immunoprecipitation ）首先通过5'-甲基胞嘧啶抗体去特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，接着通过高通量测序在全基因组水平上对CpG密集的高甲基化区域进行研究。这种技术可以发现基因组中高度甲基化的区域，如CpG岛，但不能进行单个碱基水平的分析，能够检测150bp分辨率的甲基化位点