作者：邓贵鹏，南京农业大学硕士在读，主要研究青枯菌多态性与动态阻控；尹悦，南京农业大学博士在读，主要研究根际微生物互作。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍青枯病菌如何通过基因突变和转录调控重组毒力调控网络以增加其在抗性植物品种上的适应性，原文于2020年发表在《Mol Biol Evol》上。植物和病原菌间的互作关系以军备竞赛的形式不断得在发生变化。在抗性植物的层层防御下，病原菌的攻击策略也在不断地更新升级。病原菌的进化和适应潜力是决定其成功定殖宿主并增殖的关键因素。因此表征病原菌的适应性潜力对人们更好地了解病原菌进化策略，寻找高效防控病原菌的手段具有重要意义。研究中作者利用实验进化学的手段，结合表型、基因组学和转录组学来评估植物病原青枯菌在抗性番茄品种上的适应性潜力。研究发现，青枯菌通过基因突变和转录调控重组毒力调控毒力网络增强其在抗性品种中的适应性。从表型、基因组学及转录组学多层面探究病原青枯菌克服番茄数量抗性的潜力。
作者选用抗性番茄品种夏威夷7996和病原青枯菌GMI1000作为研究材料，采用实验进化学的方法，使病原菌在番茄植株上连续转接35次（病原菌大约经历了300世代）。作者设置5个生物学重复，并将进化后获得的5个种群分别命名为A、B、C、D、E，从每个种群中随机挑取5个菌株，并将这25个衍生菌株进行表型分析以测量其适应度增量。之后，对其中10个进化菌株进行基因组和转录组测序，并与原始菌株进行比较，然后从功能上研究了病原菌基因组修饰对增强其在番茄植株中适应性的贡献。作者通过计算各个菌株的竞争指数对比了25个进化菌株与原始菌株在番茄植株茎内的适应性（图1）结果发现，除了c3菌株，其余进化后的菌株相比原始菌株在番茄植株茎内均具有更好的适应性，其中种群A和B中各个进化后的菌株相比其他种群中的菌株拥有相对更高的竞争指数，这可能是由于这两个种群中的菌株可以更快的积累适应性突变或固定不同的适应性突变。图1 原始菌株GMI1000和各进化菌株在番茄植株上的竞争指数值（CI）
为了确定实验进化过程中与适应性增加相关的基因组多态性，作者使用Illumina和Pacbio测序技术对10个进化后的菌株（每个种群挑选2个菌株）进行全基因组测序。通过与原始菌株GMI1000的基因组序列比对后发现，每个进化菌株的基因组多态性介于0和2之间。在所研究的10个进化菌株中，有5个没有检测到基因组多态性（表1）。表1 原始菌株GMI1000和实验进化菌株之间的基因组多态性为了研究在进化菌株a1、b1、b4、e1和e3中检测到的基因组多态性的适应性优势，作者构建了每个适应性菌株的突变体，其中mAG68携带soxA1C639R单碱基突变，mAG69携带RSp1574V95L单碱基突变，mAG70携带ISrso9插入突变，mAG71携带RSc3094R162R单碱基突变，mAG72携带RSp1136C-218A单碱基突变。实验发现，所有构建的突变体的竞争指数均显著高于原始菌株GMI1000，表明在夏威夷7996番茄品种中所有突变体都比原始菌株具有更好的适应性（图2）。图2 在番茄植株中原始菌株GMI1000和各等位突变体的竞争指数值
为了验证在soxA1、RSp1574和RSc3094基因编码区检测到的三个基因组多态性的功能丧失突变导致适应性增加的假设，作者敲除了GMI1000菌株中的这三个基因。从图3中可以看出，这三个缺失突变体的竞争指数均明显低于原始菌株GMI1000（图中mAG65、mAG66和mAG67分别对应△soxA1、△RSp1574、和△RSp3094），表明在实验进化过程中出现的基因组多态性并没有导致任何基因功能的丧失，而是增强了对应蛋白的功能。图3 番茄植株上GMI1000和未标记缺失突变体的竞争指数值
为了评估进化菌株的代谢效率，作者通过体外培养确定了它们的生长速率。从图4A中可以看出，在添加了谷氨酰胺的培养基中a1、b1、b4和c1的生长速率显著高于原始菌株GMI1000，在添加脯氨酸的培养基中原始菌株GMI1000的生长速率显著下降，但a1、b1、b4和c1的生长速率依旧显著高于原始菌株（图4B）。这些结果表明，这四个菌株在番茄植株中可能比原始菌株繁殖的更好，但也表明，其余六个进化菌株适应性的增加与生长速率的增加无关。在各个突变体中，只有mAG69等位基因突变体的生长速率明显高于GMI1000菌株（图4），表明mAG69生长速率的提高取决于RSP1574V95L突变，这为寻找其适应性增强的机制提供了依据。图4 在添加20mM谷氨酰胺（A）和20mM脯氨酸（B）的基本培养基中原始菌株、进化菌株和各突变体的体外生长速率
作者使用RNA测序（RNA-seq）方法研究了先前测序的10个适应性菌株的转录组学特征并与原始菌株进行比对，发现每个研究的进化菌株中的差异表达基因数量与相应基因组中检测到的突变数量不相关。例如，进化后的a1菌株仅携带一个突变，但是差异表达的基因数量却是最高的（表2）。对来自不同种群的菌株的差异表达基因库进行比对，发现进化后菌株的转录组学图谱存在大量的重叠，揭示了转录组特征的强收敛性（图5）。表2 进化后的菌株和原始菌株GMI1000间的差异表达基因
图5 来自四个独立进化后种群的五个菌株的差异表达基因分组（与原始菌株相比）
为了揭示在番茄植株上适应性菌株的适应机制所涉及的功能，作者对差异表达基因进行了基因功能富集分析，结果表明：1）a1和c1菌株中的几种功能（如趋化性、运动、信号活性和代谢过程）普遍上调；2）与蛋白质分泌过程相关的基因在b1、b4、c1和c2菌株下调基因中显著富集（表2）。
与原始菌株相比，菌株a1和c1的代谢功能基因表达重组强烈，生长速率增加，分析发现这些菌株的efpR基因显著下调。efpR之前被证明是一个协调多重毒力和代谢功能基因表达的主要调控基因，并且功能缺失突变与青枯菌的适应度增加相关，因此作者猜想efpR的下调是a1和c1适应性增加的关键。为了研究在适应性菌株中efpR基因发挥的作用。作者比较了GMI1000、a1、c1和efpR突变体在平板上的菌落形态（图6A），结果发现，原始菌株GMI1000只有一种菌落形态（S型，粘液型），efpR突变体、a1和c1均产生两种菌落形态，S型和EV型（非粘液型），同时efpR突变体、a1和c1在添加了谷氨酰胺或脯氨酸的基本培养基中生长速率增加的模式相似（图4），进一步证实了efpR的下调可能是a1和c1在番茄植株茎内获得适应性增强的主要原因。
此外，10个进化后的菌株，除了a4，其余菌株hrpB调节子的表达都有一定程度的下调。在菌株a1、c1和b4中，T3SS和相关效应器的下调达到hprB调节子的40%。因此，为了探究在进化的菌株中，Ⅲ型分泌是仅在其功能上减少还是非功能性的。作者比较了进化菌株在抗性植物上诱导HR（植物抗病的超敏反应）的能力，这一特性取决于T3SS的功能，并由hrpB控制。对先前测序的10个进化菌株在烟草和本氏烟草叶片上进行了HR测试，测试结果表明，10个进化的菌株保留了在这些抗性植物上诱导HR的能力，类似于原始菌株 GMI1000（图6B）。
图6 efpR和hrpB基因下调的进化菌株的表型特征
作者利用实验进化学的方法，结合表型、基因组学和转录组学来评估细菌性植物病原菌青枯菌克服抗性番茄品种夏威夷7996数量抗性的潜力。研究发现每个进化菌株中的差异表达基因数量与相应基因组中检测到的突变数量不相关，作者假设表观遗传修饰可能是导致这种现象的原因，提示我们研究病原菌适应性进化机制时需要同时考虑基因和表观遗传突变。
论文信息
原名：Convergent Rewiring of the Virulence Regulatory Network Promotes Adaptation of Ralstonia solanacearum on Resistant Tomato
译名：青枯菌毒力调控网络的聚合重组提高了其对抗性番茄的适应性
期刊：Mol Biol Evol
发表时间：2020年12月11日
通讯作者：Stephane Genin and Alice Guidot
通讯作者单位：法国农科院LIPM
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