作者：吴冰琼，南京农业大学硕士在读。主要研究青枯菌生物复合污染的动态阻控
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研究发现，不同的的环境细菌和人类病原体之间常常共享相同的抗生素抗性基因（ARGs），而这个现象的背后，必然存在抗生素抗性基因的种内及种间之间的转移。水平基因转移通常可以由在染色体和质粒之间移动的转座子介导。抗性基因转位到质粒上可以通过HGT增强其传播，但尚不清楚抗生素等环境因素如何影响这一过程。为研究这一点，研究人员分析了抗生素对抗性基因转位的影响，发现更强的抗生素选择导致质粒上携带抗性的细菌比例更高。这是因为在面对抗生素选择时，多拷贝质粒上抗性基因的拷贝数增加会导致更高的表达和细胞存活率。一旦抗性基因在质粒上，它们就会为HGT的快速传播做好准备，这可以加速抗生素耐药性在微生物群落中的传播。
一、质粒中携带抗性转座子的细菌数量随抗生素浓度增加而增加
作者开发了一个耐药转座子实验系统，以分析染色体或质粒编码的耐药转座子在不同抗生素浓度下如何变化。作者使用大肠杆菌DH5α作为宿主菌株，并将一个组成性表达的tetA抗性基因插入到miniTn5转座子中（图1a），在不同抗生素浓度下培养菌株48小时，并通过DNA电泳（图1b）和定量PCR（qPCR）（图1c）测量耐药转座子的分布。在低抗生素浓度下，Sc比Sp生长得快，在高抗生素浓度时比Sp慢（图1d）。试验结果与预测结果一致，携带耐药转座子的质粒数量随着抗生素浓度的增加而增加（图1）。
图1 抗生素处理可促进转座子从染色体到质粒的转移
二、转座子的类型及其改造对结果不产生改变
为了测试图1所示结果的适用性，作者构建了具有不同启动子，抗性基因和受体质粒的多个合成转座子（图2a）。作者首先用两个较弱的启动子替换了miniTn5-tetA转座子内的构成性J23104启动子，然后，用四个常见的耐药基因ampR，kanR，cmR和smR替换了miniTn5-tetA转座子中的tetA抗性基因，并用不同的抗生素重复实验，作者还使用具有不同复制来源的合成质粒（图2d）和来自医院的扩展谱β内酰胺酶病原体的天然质粒（图2e）作为受体质粒来测量转位动力学。研究结果表明，在所有情况下，从qPCR结果中观察到携带耐药转座子的质粒数量均随着抗生素浓度的增加而增加（图2c，d）。
图2 无论启动子、耐药基因或质粒来源，抗生素选择可增加耐药转座子的拷贝数
作者通过测量具有不同转位机制的合成转座子的动力学，进一步验证了发现的可推广性。在已知细菌中发现的转位机制已分为29种类型和38种亚型。从每个亚型中选择一个或两个插入序列，并构建相应的合成复合转座子。每个复合转座子包含原始插入序列和抗性基因插入（图3a）。作者将每个复合转座子整合到DH5α宿主菌株的染色体中，然后测量当改变四环素（Tet）浓度时在质粒上的转座子的比例，并测量具有高转位速率（图3b）和低转位速率（图3c）的插入序列的比例。在所有处理中，质粒传播的插入序列的比例随着抗生素浓度的升高而增加。
图3 无论转座子类别，抗生素选择可促进染色体到质粒的转移
作者同时利用天然复合转座子测试了转位动力学假说。作者选择大肠杆菌DH5α和F质粒上的Tn10转座子作为模型系统。F质粒和受体质粒之间可能发生转位。根据作者提出的机制，Tn10转座子将在较高抗生素浓度下在受体质粒上富集。结果显示，最初仅位于F质粒上的Tn10的比例随着Tet浓度的增加而在受体质粒上增加。因此，转位动力学假说也适用于低拷贝数质粒（F质粒）。
三、抗生素浓度的增加可以促进抗性质粒在种内和种间的传播
抗性基因从环境分离株转移到病原体的假设机制是：如果抗性质粒是可移动的，则在质粒上富集ARGs可以使ARGs传播到其他菌株。因此，作者创建了一种由两种大肠杆菌菌株组成的合成混合培养物（图4a），并创建一个数学模型来预测抗生素处理后混合培养物中的菌株和质粒分布。图4b显示了在各种浓度下供体和受体菌株中模拟的菌株组成，以及预测的质粒和转座子组成。图4c则为具体实验结果，在没有Tet的情况下，受体菌株始终占主导地位。供体中一小部分质粒获得了转座子，可能是由于自发转位导致的，受体细胞中则有更小部分的质粒含有转座子。在Tet = 0.5μg ml−1时，供体菌株占主导地位。供体菌株中含有转座子的质粒分数与在没有Tet的情况下观察到的比例相似。这表明低Tet剂量没有选择转位到供体中的质粒，但它足以抑制更敏感的受体细胞的生长。在前3天，受体中只有一小部分质粒含有转座子；5天后，受体中几乎所有质粒都含有转座子。在Tet = 5μg ml−1时，供体在第1天占主导地位，但受体在第2天后主导（图4c）。在这种高剂量下，供体和受体菌株中的所有质粒都含有转座子。这些实验证实了数学模型的预测，并实证验证了抗生素选择可能导致转座子上抗生素耐药性的HGT增加。
图4 群体内转座子可以在两个菌株混合培养的群体间转移转座子以应对抗生素处理
为了进一步测试转位动力学在中间传播的普遍性，作者使用67种菌株的混合培养物重复了实验。混合培养物中菌株组成和质粒分布随时间的变化（图5a）遵循模型预测和双菌株混合培养的结果。条形码测序证实，混合培养物在实验过程中保留了大量的菌株多样性（图5b），尽管每种菌株的相对丰度发生了变化。研究结果表明，抗生素的选择不仅维持了高抗生素浓度的耐受性供体菌株水平，而且还通过接合加速抗生素耐药性向敏感受体菌株的传播。
图5种群内转移使67个成员混合培养物中的转座的种群间转移响应抗生素处理
作者首先构建了动力学模型对实验结果进行预测，并通过实验证明抗生素的增加可以促进耐药基因在种内和种间的传播。为进一步证明实验的可靠性，作者通过改变转座子类型、不同转移机制转座子等方式进行验证，发现该机制具有广泛性。最终，作者发现较高浓度的抗生素将导致更高的耐药基因传播率，为HGT传播ARGs的机制提供了明确的试验证明。
论文信息
原名：Intra- and interpopulation transposition of mobile genetic elements driven by antibiotic selection
译名：由抗生素选择驱动的可移动遗传元件的种内和种间转移
期刊：Nature Ecology & Evolution
发表时间：2022.03
通讯作者：Lingchong You
通讯作者单位：Department of Biomedical Engineering, Duke University, Durham, NC, USA
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