作者：王男麒，西南大学柑桔研究所/国家柑桔工程技术研究中心讲师，主要从事柑橘栽培与生理、根-微生物互作等研究工作。
间作即指同一地块同时种植至少两种作物的生产模式，因其在养分资源高效利用、增加生物多样性、促进病虫害防治和生产力提升方面的优越性，被视为实现绿色可持续农业和产能提升的重要途径之一。花生是世界上第五大油料经济作物，其中中国的产量占全世界产量的40%，而华北地区贡献了世界范围内近20%的产量（图1a）。然而，该区域分布广泛的高pH石灰性土壤极其容易导致花生缺铁，是高产稳产和品质提高的主要限制因子之一（图1b,c）。本文的研究发现铁高效的机理II植物玉米与铁低效的机理I植物花生间作能明显改善花生铁营养和产量（图1b,c），玉米/花生间作作为我国所特有的生产体系蕴涵了国际铁营养和根际生物互作研究的前沿和热点科学问题，虽然过去的二十多年针对玉米花生间作改善作物铁营养的效应和机制从铁营养关键基因表达、转录组、蛋白组及其生理生态功能进行了系统和深入的研究，但始终是从植物之间相互作用(plant-plant interactions)的层面关注机理II和机理I植物互作互惠的分子生态机制，目前尚不清楚相关微生物是否在该体系中起到改善作物铁营养的作用。
1、根际微生物组有助于花生/玉米间作改善花生的铁营养
首先，作者在温室条件下重现了花生/玉米间作对花生铁营养的改善作用。具体而言，从播种后53d（days post sowing, dps）开始，间作提高了花生新叶SPAD值（表征相对叶绿素含量）、活性铁浓度（表征缺铁程度）和根际中的有效铁浓度（表征可以被植物吸收利用的铁）（图2a,b）。相比之下，单作花生在53 dps时，新叶开始出现缺铁性黄化，并随时间的推移逐渐恶化（图2a,b）。
随后，为了测试根际微生物组是否参与间作花生中观察到的铁营养改善作用，作者在正常（未灭菌）和灭菌的土壤中重复了间作实验（图2c）。对于所有三个测量参数——SPAD、新叶活性铁和根际中的有效铁——土壤处理（灭菌与正常）和种植类型（间作花生与单作花生）之间存在显著的统计学相互作用，表明间作花生只有在存在功能性根际微生物组的情况下才获益并改善花生铁营养（图2d）。
2、从玉米根际交叉富集到花生根际的假单胞菌属与改善花生铁营养有关
a）间作改变根际微生物群落结构。鉴于根际微生物组对于改善间作花生的铁营养至关重要，作者假设间作通过改变花生根际微生物组来改善铁的获取。为了验证该假设，作者使用16S rRNA扩增子测序在四个时间点（46、53、63和73 dps）分析了花生和玉米的根际微生物组。根际细菌群落在各个阶段形成4个不同的簇（单作花生、单作玉米、间作花生、间作玉米），在73 dps时差异最大（图3a）。相比于花生和玉米分别单作，二者间作后的根际微生物组成更为相似（图3a）。总而言之，间作既会引起微生物组组成的变化，又会引起花生和玉米微生物组之间的趋同。
b）假单胞菌属是与改善铁营养密切相关的最强生物标志物。为了检测与改善铁营养相关的关键细菌分类群，作者采用了线性判别效应大小分析（Lda Effective Size，LefSe）。在属水平上鉴定了10个生物标志物（绝对LDA分数> 3.0且p < 0.05），与单作花生相比，这些生物标志物在间作花生中含量丰富并且与单作花生相比，在单作玉米中含量更高（图3b)。因此，这些类群是间作中从玉米到花生交叉富集的最佳候选者。作者进一步发现，这10个属的丰度与新叶中的活性铁或根际中的铁有效性这两个指标呈正相关（图3b）。虽然五个属（假单胞菌属、假黄单胞菌属、黄杆菌属、根瘤菌属、鞘氨醇属）与两种铁指标均呈正相关，但假单胞菌属与根际铁有效性的关联性最强（Spearman's ρ = 0.81）（图3b）。因此，作者的分析揭示了可能参与间作花生铁营养改善的五个关键类群，其中假单胞菌是首选。
图3：间作诱导根际细菌群落组成的变化，并揭示了假单胞菌是参与间作花生铁营养改善的最佳候选分类群之一
3、间作花生根际假单胞菌表现出较高的铁载体分泌能力
由于铁载体溶解铁的能力很强，作者推测间作中根际细菌分泌的铁载体可能是花生根际铁生物利用度增强的原因。为了检验这一假设，作者使用铬天青S（CAS）平板测定法从间作花生中分离出分泌铁载体的根际细菌（图4a）。作者分离出超过300个分泌铁载体的根际细菌菌株，其中46个菌株具有特别高的铁载体分泌活性（CAS平板上的晕直径> 5mm，图4b）。在最强的铁载体生产者中，58.7%是假单胞菌属（根据其16S rRNA序列），并且这些菌株中的大多数（63.0%）与通过DADA2算法获得的代表性扩增子序列变体（ASV487）具有 > 97% 的序列一致性，捕获了假单胞菌属的一个特定分支（图4b）。重要的是，ASV487在单作花生中检测不到，但在间作花生中可检测到，并且其相对丰度在单作玉米中高于间作玉米（图4c）。此外，在铁营养转变的关键阶段（46-53 dps）以及单作和间作花生之间铁营养差距最大的阶段（73 dps），在间作花生根际分离到了ASV487类似菌株。这些结果表明，ASV487 代表一类高铁载体分泌假单胞菌菌株，它们在间作过程中从玉米到花生交叉富集，并与改善花生的铁营养有关。
接下来，作者重点关注假单胞菌1502IPR-01，该菌株与ASV487有97.7%的相似性，并且在分离的菌株中具有最高的铁载体分泌能力（图4b）。以假单胞菌1502IPR-01为代表菌株，实验探究其在间作花生中铁营养改善中的作用。通过全基因组测序发现假单胞菌1502IPR-01与极端东方假单胞菌相似（图4d）。通过对其基因组进行同源基因比对，作者检测到pyoverdine生物合成和分泌基因簇与铜绿假单胞菌PAO1（pyoverdine研究的模式菌株）的同源基因具有51.4-84.1%的蛋白质序列一致性（图4e）。
为了确认假单胞菌1502IPR-01确实分泌pyoverdine作为其主要铁载体，作者在铁限制培养基中培养1502IPR-01后，从上清液中分离出铁螯合化合物。结构解析和化学分析证实了假单胞菌1502IPR-01分泌的主要铁载体是pyoverdine（图4f）。
接下来，作者评估了pyoverdine与悬浮液中不溶性Fe(OH)3源的Fe(III)结合的活性。Fe(III)螯合表现为颜色从透明到黄色再到棕色（图4f）。溶液中的螯合铁浓度随着等摩尔量的pyoverdine添加而增加，与pyoverdine- Fe(III)复合物的颜色变化相匹配（图4f）。总之，研究结果将pyoverdine确定为假单胞菌1502IPR-01分泌的主要铁载体，并表明其高效地从不溶性Fe(OH)3中溶解Fe(III)，而Fe(OH)3为石灰性土壤中铁的主要形式。
图4：功能性产铁载体根际细菌及其铁载体表征
4、假单胞菌1502IPR-01及其pyoverdine在温室和田间试验中改善花生铁营养
为了通过实验验证假单胞菌是通过分泌pyoverdine改善铁营养的关键微生物，作者进行了温室和田间实验。对于温室实验，作者在无菌石灰性土壤中以种植单作和间作花生，不进行处理作为对照，使用假单胞菌1502IPR-01或其不含铁的pyoverdine作为处理。两种处理均显著提高了SPAD值，提高了新叶活性铁和根际有效铁浓度，提高了单作和间作花生的花生生物量（图5a,b）。在普通非无菌土壤中重复实验时，观察到了同样的显著改善作用（图5b）。因此，假单胞菌1502IPR-01和pyoverdine处理可以部分回补灭菌诱导的花生缺铁，因为在灭菌土壤中间作和单作花生中缺乏功能性微生物组。
接下来，作者研究了假单胞菌1502IPR-01及其不含铁的pyoverdine能否应用于缺铁矫治。作者使用假单胞菌1502IPR-01或pyoverdine（均通过根部浇水施用）在华北平原的两个石灰性土壤中进行田间试验。在这两个地点，处理均显著增加了SPAD值、新叶中的活性铁浓度、根际铁有效性和作物产量（图5c,d）。1502IPR-01或其pyoverdine增加花生铁营养和产量的程度与传统的叶面喷施EDTA-Fe处理相似，在一种情况下甚至超过传统的EDTA-Fe处理（图5d）。这些结果表明，1502IPR-01和pyoverdine可以有效地螯合田间石灰性土壤中的Fe(III)，这种机制有助于提高花生铁营养和作物产量。因此，pyoverdine可以被视为可持续农业的铁肥料，利用土壤中难溶的铁，而不需要外部铁供应。
图5：假单胞菌1502IPR-01及其铁载体pyoverdine可矫治缺铁黄化并改善花生生长和产量
5、验证实验表明pyoverdine直接影响植物铁代谢
为了在功能上验证pyoverdine有助于改善花生铁营养，作者用pyoverdine合成突变体进行了实验（图6a）。实验室菌株铜绿假单胞菌PAO1和天然分离株假单胞菌1502IPR-01均显著改善了单作花生铁营养和生物量。与此形成鲜明对比的是，用铁载体缺陷突变体PAO1 ΔpvdDpchEF 处理（图6b）对植物没有有益作用，表明pyoverdine是改善花生铁营养所必需的。
然后，作者研究了pyoverdine是否反馈调节植物自身铁吸收系统的活性。事实上，在铁载体缺陷突变体存在的情况下，花生的铁螯合物还原酶（FCR）活性显著上调（图6b），但在施用野生型菌株和添加pyoverdine时下调（补充图24）。在玉米中也发生了相同的反应，在假单胞菌1502IPR-01或其pyoverdine存在下，玉米下调了其植物铁载体DMA的分泌（补充图24）。这些实验强调pyoverdine直接影响植物的铁代谢。
图6：假单胞菌分泌的Pyoverdine对提高花生铁营养和生物量至关重要
补充图24：假单胞菌1502IPR-01菌株和pyoverdine降低花生和玉米的关键缺铁反应
该研究阐明了间作如何通过根际微生物组趋同使植物受益的机制，即通过交叉富集从玉米根际中获得特定假单胞菌，分泌铁载体pyoverdine，提高根际铁有效性，进而改善花生铁营养（图7），未来间作机制解析应重视植物-微生物-植物互作这一研究方向。研究结果为植物根际促生菌处理以及在无法进行间作的情况下如何用功能菌株和功能代谢物改善植物铁营养和作物产量提供了应用机会。该研究利用突变体首次证实微生物改善植物铁营养依赖其铁载体分泌，并揭示了微生物铁载体介导的植物铁吸收途径直接影响植物自身的机理I和机理II铁吸收途径。这些研究结果为植物铁吸收的机制见解提供新视角，并引发对其他间作系统与其他植物组合以提高作物产量和农业可持续性的兴趣。对植物-微生物-植物间相互作用机制的详细了解将有助于发展生态可持续的农业，保证粮食安全。
论文信息
原名：Microbiome convergence enables siderophore-secreting-rhizobacteria to improve iron nutrition and yield of peanut intercropped with maize
译名：玉米/花生间作微生物趋同性驱动产铁载体微生物改善花生铁营养和产量提升
期刊：Nature communications
DOI：10.1038/s41467-024-45207-0
发表时间：2024.1
通讯作者：王明，韦中，左元梅
通讯作者单位：中国农业大学，南京农业大学
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