作者：陈乙一，南京农业大学硕士在读，主要研究青枯菌Ⅲ型分泌系统影响根际免疫的效应与机制。
植物病原病毒、细菌、真菌和卵菌在自然生境和农业环境中引起破坏性疾病，从而威胁植物生物多样性和全球粮食安全。目前的研究大多集中在单一的致病菌株是引起疾病的决定因素，却忽略了这个致病菌株也是微生物群落的一员。这些微生物群落如同一个个“社区”，社区成员之间复杂的关系和相互作用可能会导致致病菌株无法适应社区环境，影响致病性。在一些情况下，部分菌株可产生一些外泌因子，这些因子可被自身菌株和邻近微生物利用，促进微生物群落内部正向互动，因而被称为“公共物质”，生产“公共物质”的社区成员被称为“合作者”，而与此同时社区内部也存在光吃不做的利己主义者，这部分社区成员则被称为“拿来主义者”。许多革兰氏阴性菌的致病性依赖于 III型分泌系统，该系统通过将众多效应蛋白注射到植物细胞中，破坏植物免疫以形成允许病原体有效侵染的环境。作为外泌因子，效应蛋白可否作为“公共物质”促进微生物群落内不同菌株的互作，有待揭示。
因此， 效应蛋白具有成为“公共物质”的潜力。
病原菌外泌的效应蛋白可否作为“公共物质”促进不同菌株协作，进而产生协同毒力？
为了回答上述科学问题，作者以丁香假单胞菌（PtoDC3000）为模式菌株，构建了无效应蛋白菌株（敲除36个效应蛋白，D36E），该菌株完全丧失对宿植物的侵染能力。回补任何一个效应蛋白都不恢复D36E的致病力，但将36个效应蛋白回补的菌株组装成元克隆（mate clone）时，元克隆可恢复D36E的致病力，表明效应蛋白之间的协同作用促进病原菌致病性的恢复。随后，考虑到丁香假单胞菌效应蛋白极高的生物学相关性，作者将原产于丁香假单胞菌PmaES4326的效应蛋白等位基因转移到PtoDC3000中，发现独立进化的效应蛋白同样可以驱动这种协作行为。将这些效应蛋白克隆到植物促生菌荧光假单胞菌中，组装的元克隆开始对拟南芥致病，此时将有益细菌转化为病原菌。这些结果强调了微生物群落内部相互作用的重要性，并扩大了病害可能归因的生态规模。
1、效应蛋白协同作用促进病原菌致病性的恢复
为了探究丁香假单胞菌不同效应蛋白对病原菌致病性的影响以及成为“公共物质”的潜力，作者通过操纵PtoDC3000菌株内部效应蛋白的组成，组装了不具有致病性的无效应蛋白菌株PtoDC3000D36E（以下简称为D36E），36个单效应蛋白回补菌株，以及包含36个单效应蛋白回补菌株的元克隆菌株（图1a）。
首先，为了测试单个效应蛋白能否恢复原菌株的全部毒力，作者通过喷雾接种法将36个单效应蛋白回补菌株接种到拟南芥上进行毒力测定，发现它们的生长水平与无致病性的D36E没有统计学差异，结果表明：单个效应蛋白无法恢复原菌株的全部毒力。
在此基础上，作者推断只有在部分或全部效应蛋白的协同作用下才能恢复原菌株的全部毒力。为此，作者通过喷雾接种法将包含36个单效应蛋白回补菌株的元克隆菌株D36E::McDC[36]及缺少触发拟南芥ETI功能的效应蛋白AvrE1f的元克隆菌株D36E::McDC[35]接种到拟南芥上进行毒力测定，发现
D36E::McDC[35]与原菌株生长水平没有统计学差异，D36E::McDC[36]与D36E生长水平没有统计学差异（图1b）。通过追踪整合到效应蛋白质粒中的独特序列，作者发现没有一个单效应蛋白回补菌株在感染过程中持续存在，结果表明：部分或全部单效应蛋白回补菌株之间的协同作用起到了促进种群适应性和恢复致病性的作用。而D36E::McDC[36]与D36E::McDC[35]之间存在约2个对数的生长差异（图1b），结果表明：效应蛋白AvrE1f诱导宿主细胞产生免疫抗性（ETI），包含该效应蛋白的元克隆（D36E::McDc[36]）宿主体内定殖能力显著弱于不诱导ETI的元克隆（D36E::McDc[35]），这表明AvrE1f是一个有害的“公共物质”，会降低种群适应性和致病性。
图1 丁香假单胞菌元克隆的组装促进了致病性的恢复
2、协同毒力可使种内和种间的“拿来主义者”受益
单个效应蛋白回补菌株不能恢复致病性，但在组成了元克隆后，却可以在集体作用下协助毒力的恢复，表明这一菌株是不提供“公共物质”，却从中受益的“拿来主义者”。为了证明元克隆菌株内效应蛋白的协同作用是否会被光吃不做的“拿来主义者”利用，作者通过混合生长测定发现与无效应蛋白菌株D36E相比，与元克隆菌株D36E::McDC[35]混合生长的“拿来主义者”菌株生长水平显著增强（图2b），结果表明：元克隆菌株内效应蛋白的协同作用会被具有相同遗传背景的“拿来主义者”利用。为了进一步证明效应蛋白的协同作用可以使不同物种的“拿来主义者”受益，作者通过引入无毒的天然荧光假单胞菌0-1（Pf 0-1）进行混合生长测定，发现与无效应蛋白菌株D36E相比，与元克隆菌株D36E::McDC[35]共接种后的Pf 0-1生长水平增加了3个对数以上（图2c）。结果表明：元克隆菌株内效应蛋白的协同作用可以被同一环境下相同/不同物种的“拿来主义者”菌株利用。
图2 元克隆菌株内效应蛋白的协同作用促进相同/不同物种“拿来主义者”菌株生长
3、效应蛋白协同毒力可在种内转移
为了探究效应蛋白是否只能随着携带它们的菌株共进化，由此表现出协同毒力，这样的结果能否推广到其他的效应蛋白系统中，由此作者引入了与PtoDC3000具有生物学相关性的P. syringae pv. maculicola ES4326（PmaES4326）菌株，其核心基因组与PtoDC3000不同（图3a）。菌株之间只有8个等位基因共享，这导致等位基因水平的Jaccard相似性值为0.14（图3b）。将原产于菌株PmaES4326的效应蛋白等位基因转移到同种但分化的菌株PtoDC3000中，组装了诱导ETI的元克隆菌株D36E::McES[30]和非诱导ETI的元克隆菌株D36E::McES[28]（图3c）。通过喷雾接种法进行毒力测定发现与无效应蛋白菌株相比，D36E::McES[28]显著恢复了植物的生长，而D36E::McES[30]则没有（图3d）。结果表明：元克隆菌株内效应蛋白协同作用在功能上相对独立，但是在一定程度的进化范围内是可以转移的。
图3 病原体效应蛋白协同作用的可移植性
4、效应蛋白协同毒力可在种间转移
最后，为了探究效应蛋白的协同毒力是否可在不同物种间转移，作者引入了有益菌荧光假单胞菌Pf01EtHAn（Pf01），通过将PtoDC3000和PmaES4326的效应蛋白克隆到有益菌Pf01中，组装了诱导ETI的元克隆菌株PfEtHAn::McDC[36]和PfEtHAn::McES[30]，以及非诱导ETI的元克隆菌株PfEtHAn::McDC[35]和PfEtHAn::McES[28]。随后，通过毒力测定发现装载了PtoDC3000的效应蛋白（剔除诱导ETI的效应蛋白AvrE1f）的元克隆（PfEtHAn::McDC[35]）具有和原菌株PtoDC3000一致的宿主体内定制能力，装载了PmaES4326的效应蛋白（无诱导ETI效应蛋白）的元克隆亦然。而不诱导ETI的元克隆在宿主体内的生长水平与无效应蛋白菌株D36E相当。结果表明：效应蛋白的转移足以使有益菌转化为病原菌，效应蛋白的协同毒力可以在不同物种间转移。
图4 效应蛋白的转移足以将有益菌转化为病原菌
尽管在多种微生物和多克隆感染中相互作用的重要性越来越得到人们的重视，但大多数传染病研究仍然集中在单一毒株的作用上，而本文通过实验表明毒力可以通过微生物群落内部菌株的相互作用实现，效应蛋白作为一种“公共物质”，可以协助支持环境中“拿来主义者”菌株的生长，效应蛋白组合可以在独立进化的背景下发挥作用，如果提供适当的效应蛋白和分泌系统，有益物种可以转化为病原体。基于以上结论，本文强调了在研究发病机制的过程中纳入不同微生物群落中发生的相互作用的影响的重要性。
论文信息
原名：Cooperative virulence via the collective action of secreted pathogen effectors
译名：众多T3Es集体作用产生协同毒力
期刊：Nature Microbiology
DOI：10.1038/s41564-023-01328-8
发表时间：2023.04
通讯作者：Darrell Desveaux；David S. Guttman
通讯作者单位：多伦多大学细胞与系统生物系；多伦多大学基因组进化与功能分析中心
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