作者：许家正，南京农业大学博士在读，主要研究铁载体与菌群互作
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊介绍铁载体pyoverdine增强细菌抗生素抗性。原文于2024年2月发表在《Nature microbiology》上。Cefiderocol（头孢地尔）是一种新型铁载体头孢菌素类抗菌药物，其可通过铁载体基团螯合三价铁，并利用铁转运蛋白转运至革兰氏阴性菌周质中，发挥抗菌活性。Cefiderocol可有效治疗对多种药物具有抗性的革兰氏阴性细菌的感染，但在临床上已出现对该药物的耐药性，而其中机制尚不清楚。本文通过进化实验，发现对cefiderocol产生耐药性的铜绿假单胞菌，受多因素影响产生多重药物耐药性，并在无cefiderocol的环境中付出适应成本。然而，亲缘选择会推动一些耐药菌群通过双组分传感器cpxS基因突变，增加铁载体pyoverdine分泌，从cefiderocol中争夺铁，最终减少易感细胞对cefiderocol摄取，产生交叉保护作用。同时，从临床分离株证实，pyoverdine的产生与cefiderocol耐受性直接相关，高产pyoverdine的分离株对易感铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性细菌具有交叉保护作用。总而言之，铁载体可交叉保护细菌免受抗生素作用，且独立于抗生素降解机制。
文章使用实验进化方法在两种模拟宿主环境培养基（合成囊性纤维化痰液：SCFM2，合成人尿：SHU）中测定铜绿假单胞菌对cefiderocol抗性的染色体突变。同时，采用浮游条件（SCFM2和SHU）以及作为生物膜聚集形式（SCFM2）来模拟在两种感染条件下可能发生的生长模式。文章将在不同培养基预适应后的菌群在不断增加的cefiderocol浓度中进行传代（图1a），发现营养环境和生长模式影响了cefiderocol抗性出现的速率（图1b）。为确定cefiderocol抗性突变，文章对进化后菌群进行全基因组测序，并将其与预适应的原始菌群进行比较。结果发现，进化后的菌群在遗传上是多样的，cefiderocol选择了多重耐药突变。在对cefiderocol进行实验进化的菌株中，发现了涉及铁代谢的基因突变，如pyochelin生物合成基因pchEF、cpxS、nalD和PA2550基因突变，导致耐药性增加2到8倍。piuA或piuC基因突变导致了4倍的耐药性增加。（图1e）。此外，mexR（MexAB-OprM外排泵的负调节因子）的移码突变在一个菌群中的10个菌株中被检测到（图2a, b）。这些发现表明，铁稳态的破坏以及外排泵表达的增加都对cefiderocol耐药性有贡献。研究还发现，有12个进化后的菌株没有检测到在cefiderocol实验进化期间产生的任何新突变。这一发现意味着这些菌株的cefiderocol抗性可能不是通过获得新的遗传变异来实现的，而是通过种内合作或者说是群体间的互助行为获得。实验发现抗性突变在未接触过cefiderocol的临床分离株中也存在。其中一株的cefiderocol 最小抑菌浓度（MIC）显著高于另一个敏感株（图2e）。全基因组测序显示，与前面实验室进化实验中观察到的抗性突变一致（图2f），这些临床分离株中也出现了与铁获取相关的抗性基因的突变，包括铁载体生物合成和受体基因。这些发现提示，即使在未接受cefiderocol治疗的情况下，缺铁的宿主环境也可能影响细菌对cefiderocol的敏感性。本章结果表明，在实验进化过程中，cefiderocol选择了多重耐药性突变，这些突变涉及铁代谢、外排泵表达增强以及转录调控等多个基因。图1：Cefiderocol耐药变异影响多个基因和通路
图2：在进化的菌株和铜绿假单胞菌临床分离株中检测到的cefiderocol耐药变异
为测试特定的cefiderocol抗性突变株在没有cefiderocol的情况下是否付出了适应性代价，文章在无药物培养基中传代cefiderocol抗性菌群，并在不同时间测量其对cefiderocol的敏感性。结果发现，无论是在哪种培养基或生长模式下，所有在无药环境中传代的cefiderocol抗性菌群都恢复了对cefiderocol的敏感性（图3a）。通过全基因组测序发现，在SCFM2中重新对cefiderocol敏感的菌群有23个基因的缺失，这表明这种缺失可能是对SCFM2培养基的适应，而不是与cefiderocol抗性直接相关的突变。在无cefiderocol的环境中，SCFM2浮游菌群中反复出现的突变基因包括femR, fpvK, cupE1, argJ和dnaX，而SCFM2聚集菌群中则出现了PA1297, mexY, argJ, pprA和pprB的突变。PA1232和clpA的变异在SHU菌群中传播时固定下来，但cpxS的变异在无cefiderocol的SCFM2浮游菌群中没有维持，表明cefiderocol抗性突变株在无药物环境中存在适应性代价（图3b）。为确定cefiderocol耐药进化是否影响对其他药物的敏感性，文章测定了在cefiderocol环境中进化后的菌群对一系列临床相关抗生素的敏感性。结果发现cefiderocol耐药的菌群对其他头孢菌素、aztreonam、tobramycin以及在SCFM2条件下对多粘菌素B和 colistin的抵抗力增强，在SHU环境中进化的菌群对环丙沙星（CIP）的抵抗力也略有增加（图3c）。交叉抗药性可能由控制抗生素外排泵的基因突变引起。研究者推测cpxS和nalD变异可能是驱动交叉抗药性的原因。nalD基因编码mexAB-oprM外排泵操纵子的抑制剂，cpxS的某些变异（如cpxST163P和cpxSS227G）增加了mexA和muxA这两个外排泵表达基因的表达，表明交叉抗药性随着外排泵活性的增强而增强。进一步实验表明，当解除cefiderocol的压力后，通过连续传代，对ceftazidime（CAZ）和cefepime的敏感性可以恢复，且这与cpxS突变的丢失有关。在没有抗生素压力的情况下，在SCFM2条件下选择出的高度耐药菌群显示明显较慢的生长速率，这表明在没有cefiderocol时，cefiderocol耐药性可能带来了适应性成本。相比之下，在SHU中选择的进化菌群没有表现出显著的生长缺陷（图3d），这表明在SHU中获得的cefiderocol耐药性突变在无抗生素存在时可能几乎不或没有适应性代价。在没有cefiderocol的情况下，原始菌群在SCFM2环境中能够胜过耐药的进化菌群，而在SHU共培养中，进化菌群和原始菌群的竞争力相当，进一步证实了SHU环境中cefiderocol耐药性的突变可能没有明显的适应成本（图3e）。图3：进化出的cefiderocol耐药性支付适应成本
5、Cefiderocol选择增强协同交叉保护
文章研究了在不同环境下经cefiderocol选择进化的菌株的适应性。SHU适应的cefiderocol耐药菌群在高浓度cefiderocol（64 μg·ml⁻¹）下比敏感的原始菌群更具适应性（图3e）。8个由SCFM2环境进化而来的菌群中，有5个在cefiderocol存在的情况下超越了敏感原始菌群（图3e和图4a,b）。令人意外的是，三个SCFM2浮游群体在cefiderocol共培养期间与敏感原始菌群具有相同的生长速率（图4c），这可能与亲缘选择有关。亲缘选择产生一类合作菌株通过产生公共有益物质，使得cefiderocol敏感的个体能在原本致命的cefiderocol浓度下生长。这种现象同样在聚集条件下被观察到，即cefiderocol耐药的进化菌群在聚集体的最外层生长，这可能保护了敏感的原始菌群免受cefiderocol的杀伤（图4d）。这种合作行为并未出现在SHU介质中进化出的菌群中，暗示亲缘选择作用仅在SCFM2环境中发生。图4：在cefiderocol耐药人群中进化的交叉保护文章进一步研究了铜绿假单胞菌对cefiderocol敏感细菌交叉保护的具体特征。研究发现某些特定的基因变异，尤其是cpxS，可增加铜绿假单胞菌对cefiderocol的耐药性并提供交叉保护作用。在含有cefiderocol的环境中，具有交叉保护的共培养体系中上调了CPX双组分系统基因和muxABC-opmB外排泵的表达。其中，cpxSS227G变异株表现出更强的交叉保护能力，能够提高野生型PAO1对cefiderocol的耐受性（图4h, i）。考虑到MuxABC-OpmB在pyoverdine分泌中的作用，文章推测由MuxABC-OpmB分泌的pyoverdine可以作为一种合作公共物质来保护敏感细菌。研究发现，这些保护性共培养增加了pyoverdine的分泌（图5a），而pyoverdine可通过与cefiderocol竞争铁离子（图5b）来降低其活性，从而起到保护作用（图5c）。此外，临床分离株的pyoverdine产生量与其对cefiderocol的敏感性正相关（图5d），这些发现表明，增加pyoverdine产量代表了增加cefiderocol抗性的一种表型机制（图6）。同时，其他细菌产生的铁载体，如enterobactin，也显示了类似保护效果。在种间共培养中，cpxSS227G变异株相较于PAO1更能保护克雷伯氏肺炎菌和大肠杆菌免受cefiderocol的杀伤（图5g,h），这与它们产生的pyoverdine水平有关（图5m）。这表明，增加pyoverdine分泌的变异株可通过铁离子竞争，限制了细菌对cefiderocol吸收，提供交叉保护（图5i–l,n）。本文对铜绿假单胞菌的抗生素cefiderocol耐药性产生进行研究发现，多因素导致耐药性的产生，且伴随着多重药物耐药性和适应性成本。通过实验进化，文章明确了其中一种耐药机制，即通过双组分传感器cpxS突变增加铁载体pyoverdine的分泌，从而保护易感个体免受抗生素的杀伤。pyoverdine和enterobactin等铁载体均可从cefiderocol中夺取铁，阻止其被易感细胞吸收，从而实现交叉保护。临床分离的铜绿假单胞菌中，铁载体pyoverdine的产量与cefiderocol的耐受性直接相关，高产pyoverdine的菌株可以保护铜绿假单胞菌和其他革兰氏阴性菌。总的来说，铁载体交叉保护细菌抵御抗生素，且不依赖抗生素降解的机制，铁载体在微生物群落中发挥着协同保护作用。
图6：Cefiderocol的耐药性和交叉保护机制。 a、Cefiderocol抗药性是多因素的。文章在持续cefiderocol压力下鉴定到与药物摄入、药物外流、转录调控、代谢以及功能未知的假设基因相关联的突变体。转录调控因子（nalD）或双组分系统（cpxS）的突变可能调节涉及cefiderocol摄入的外流泵（mexAB-oprM）或铁运输蛋白（piuA、pirA、fpvA、fptA）的表达。尽管药物靶点修饰是一种常见的耐药机制，但我们没有在ftsI（PBP3，标记为灰色）中检测到突变。因此，cefiderocol抗药性主要是由增加的药物外流或限制cefiderocol摄入驱动的。另一个耐药机制涉及增加的pyoverdine分泌（通过muxABC-opmB），它可以与cefiderocol中的铁形成螯合物，限制cefiderocol的摄入。b、细菌铁载体作为公共物品通过合作促进细菌的交叉保护。为了被细菌细胞内部运输，cefiderocol必须在螯合三价铁的形式下。对三价铁具有高亲和力的铁载体可以直接从cefiderocol中置换铁，从而限制其摄入。对于敏感的铜绿假单胞菌和多微生物群落的成员，通过cefiderocol耐药合作者慷慨产生的pyoverdine的分泌和扩散实现了交叉保护。论文信息
原名：Siderophores promote cooperative interspecies and intraspecies cross-protection against antibiotics in vitro
译名：铁载体促进体外对抗生素的种间和种内协同交叉保护
期刊：Nature microbiology
DOI：10.1038/s41564-024-01601-4
发表时间：2024.2
通讯作者：Peter Jorth
通讯作者单位：美国加利福尼亚州洛杉矶 Cedars-Sinai 医学中心生物医学科学系医学系
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