作者：武娜妮，南京农业大学硕士在读，主要从事秸秆高值化利用方向秸秆高效降解菌群的筛选研究。
周刊主要展示LorMe团队成员优秀周报，每周定期为您奉上学术盛宴！本期周刊为您介绍通过木质纤维素水解酶的多组学研究揭示了一种源自于P. putredinis NO1菌株所产生的新型木质素酶活性，原文于2021年发表在《PNAS》上。
木质纤维素是植物细胞的结构成分，是一种主要的农业副产品，也是地球上生物聚合物最丰富的陆地来源。木质纤维素的复杂性和不溶性限制了其转化为增值商品，目前，高效转化需要昂贵的预处理和高负荷的酶。在这里，我们报道了一种从小麦秸秆堆肥群落中分离出来的寄生孢子菌属真菌，当生长在木质纤维素底物上时，它分泌大量多样的碳水化合物活性酶(CAZymes)。我们描述了一种氧化酶活性，它可以裂解木质素中的主要β-醚单元，从而从单株木质素中释放类黄酮tricin，并增强多糖酶混合物对木质纤维素的消化。我们表明，这种酶在生物精炼工业中具有潜力，广泛分布于Sordariomycetes门的木质纤维素降解真菌中。
1.P. putredinis NO1的分离
以麦秸为唯一碳源的液体培养物，用麦秸富集堆肥的均质样品接种。由此，我们追踪了微生物群落的动态变化。16S rRNA基因测序在整个时间过程中从原核生物群落中产生了超过300万个数据，这些数据聚集在一起形成25304个操作分类单位（OTUs）(图1A)。鉴定出的最丰富的细菌门分别是革兰氏阴性拟杆菌门Bacteroidetes、Verrucomicrobia和Pro-teobacteria，在整个时间过程中平均占总数据的31.8%、19.8%和15.5%。对真核生物群落进行内部转录间隔区(Internal transcribe Spacer, ITS)测序的分析主要得到了与UNITE真菌rDNA序列数据库不匹配的数据。总的来说，96.5%的OTU不被认为是真菌，而是与原生动物具有最接近的同源性。在真菌中，我们注意到群落组成随时间的明显变化。特别是，作为微子囊科子囊菌的一种真菌(指定菌株NO1)，在培养4周后，其丰度增加(图1B)。在培养4周后的摇瓶中，属于石墨属的数据在真核生物群落中占主导地位，在8周时代表了84%的可识别真菌数据，我们假设，在这个时间点上，麦秸中大部分容易获得的碳源已经耗尽。通过ITS和18S分析鉴定出一株石墨同质菌株P. putredinis NO1，通过营养琼脂和马铃薯葡萄糖琼脂培养，很容易从摇瓶中分离出来。有趣的是，当琼脂板中含有牛皮木质素作为唯一碳源时，这种真菌可以被选择性地培养。
图1.麦秸降解过程中原核生物和真菌属的组成。16S和1TS扩增后在离子流平台上生成序列，分别用于(A)原核和(B)真核鉴定。操作分类单位鉴定到属水平n = 1。
2.P. putredinis NO1降解小麦秸秆组学分析
证实P. putredinis NO1 可以作为唯一的碳源在麦秸上生长，并优化了生产纤维素酶和木聚糖酶的生长培养基组成。通过测量质量损失和碳水化合物活性酶(CAZy)活性，追踪P. putredinis NO1在28 d内对麦秸的分解。该生长实验确定了在麦秸上培养的第2、第4和第10天作为不同的时间点来提取RNA进行序列分析，选择这三个时间点是因为它们一起代表了第一次检测到木质纤维素水解活性(第2天)，酶活性高峰(第4天)，以及随后木质纤维素水解活性的降低(第10天)——在这一点上，麦秸中容易获得的糖已经被利用了。从在葡萄糖上生长了4 d的P. putredinis NO1上也提取了RNA。
测序后，从339,854,704个读数中组装了5,586个独特的连续DNA序列(contigs)，差异基因分析鉴定出2,189个contigs在小麦秸秆与葡萄糖生长之间以高置信度和折叠变化上调(P < 0.001,FC > 10)。这些高度上调的基因包括编码102种推定的CAZy蛋白的基因;47种糖苷水解酶(GH)基因、41种辅助活性酶(AA)基因、10种碳水化合物酯酶(CE)基因和1种多糖裂解酶(PL)基因，其中大部分在生长4 d后上调(图2)，与P. putredinis NO1培养上清中观察到的酶活性峰值一致。
图2.葡萄糖和麦秸条件下contigs的表达变化。在小麦秸秆上菌株P. putredinis NO1培养2、4和10 d，在葡萄糖上生长4 d后提取RNA并测序。点表示麦秸和葡萄糖条件之间的对数FC和平均每百万分之数(CPM)。用dbCAN标记CAZymes，即AA、GH、PL、CE和GT，点为三个物重复的平均值。
由于木质纤维素的大分子结构阻止细胞内降解，因此通常会分泌用于其解构的酶。为了捕获这些酶，我们对直接从培养上清中收集的蛋白质样品进行了液相色谱和串联质谱(LC-MS/MS)分析，并使用生物素标记方法将与培养物的不溶性成分结合的蛋白质样品分开。从所有样本中，鉴定出3,671个蛋白质，包括仅存在于麦秸条件下的1,037个蛋白质和275个包含可识别CAZy结构域的序列。在麦秆上生长4天后，这些假定的碳水化合物水解酶占上清样品摩尔百分比的25.2%(192个蛋白质)和生物素标记样品的13.9%，而葡萄糖培养的上清样品的13.3%和生物素标记样品的2%。
最丰富的CAZy家族，分别占第4天上清和生物素标记部分的3.7%和3.6%，是GH6s(图3)。这些家族和GH7通常构成丝状真菌的主要纤维素酶，可能是内切葡聚糖酶或过程纤维素生物水解酶。其他可能对纤维素有活性的GH家族，包括GH7(通常是纤维素生物水解酶或内切葡聚糖酶)、GH5和GH45(通常是内切葡聚糖酶)以及GH1和GH3(通常是葡萄糖苷酶)家族，在分泌组中也很突出。
图3 在麦秸上培养4天后的上清(SNT)和生物素标记(BF)蛋白的摩尔百分比。糖活性家族的摩尔百分比，GH:糖苷水解酶，AA:辅助活性，PL:多糖裂解酶，CE:碳水化合物酯酶和GT糖基转移酶，被计算为注释的组合的总和，并作为每个生物重复的平均值。
3.小麦秸秆中Tricin和木质素单位的释放
最近，Tricin被描述为单子叶植物木质素中的一个亚基，通过4-O -β连锁结合。与其他农业相关的原料相比，麦秸中含有相对高浓度的tricin，我们评估了氧化酶从麦秸中释放tricin的能力。在生理条件(pH 8.5, 30℃)下，将氧化酶与麦秸共培养16 h。采用高效液相色谱(HPLC)对反应产物进行测定，参照正宗标准品鉴定出一个与tricin对应的峰，并通过质谱法确认。在P. putredinis NO1的生长条件下，与仅用缓冲液孵育相比，纯化蛋白组分的麦秸反应上清中tricin的浓度明显更高(方差分析，F(2,12) = 44.67, P < 0.05)(图4A)。通过与正宗标准品和质谱的比较，我们还能够检测到反应上清液中存在对香豆酸、香兰素和对羟基苯甲醛;然而，与tricin不同的是，这些化合物在酶处理的反应条件下不富集，可能是由于简单的酯裂解而产生的。
图4.重组氧化酶处理生物质。(A)用HPLC观察麦秸中Tricin 1的释放，并与真实标准品进行比较，并用飞行时间质谱法确定质量。(B)在使用Celluclast商业糖化混合物之前，用重组氧化酶、商业蘑菇酪氨酸酶和缓冲液处理麦秸仅16小时。用HPAEC计算反应混合物的糖释放量。误差线表示5个生物重复的SD。
核磁共振(NMR)分析(图5)分离的木质素酶(EL)(经过粗多糖酶处理以使大部分多糖糖化)和用我们的酶进行非优化处理产生的产物显示，实际木质素谱变化不大，但tricin水平明显下降。因此，尽管这种二维异核单量子相干性(HSQC)实验产生的光谱中相关轮廓的整合不能提供可靠的量化，但它们的相对值被认为是有效的。分析表明，木质素中三辛醚的相对含量从对照组的近12%下降到处理后的8.5%左右。我们最初感到失望的是，我们无法检测到β-醚单元A水平的类似降低(图5)，但注意到这些是在A + B + C = 100%的基础上“量化”的，并且很容易推测即使有一些(大概是低水平的)β-醚裂解，水平也可能不会发生显着变化;在将基础更改为以前使用的每100个芳香(S+G+H)单位的水平时，值(图5)确实证实了β-醚单位a的适度下降(67降至65)。在整个细胞壁组分(而不仅仅是分离的木质素，未显示)的光谱中，趋势是相似的，处理样品中的T6和T8轮廓特别弱，而T2 ' /6 '峰相对较强;我们之前在快速弛豫样品中注意到这种现象，并不能完全理解其起源;无论如何，处理过的材料中tricin的相对水平再次低于对照，与上面提到的tricin释放量的测量结果明显一致。
图5.(A)对照小麦和(B)酶处理小麦的二维HSQC NMR光谱(DMSO-d6:pyridine-d5，4:1,vol/vol)的木质素芳香族和侧链区域。黄框中的量化值用于相对比较由NMR轮廓体积积分确定的木质素成分，该积分基于S + G + H = 100%或A + B + C + C’，尽管后者也基于“每100个芳香环的键数”。pCA和T单位是木质素附属物;它们的水平是根据总木质素(S + G + H)来估计和表达的。木质素单体亚基的化学结构用颜色编码，以匹配它们在光谱中的信号分配。赋值来自β-醚酶活性实验确认中的论文，以及新的a - β- t赋值(79)。注意，为了更清楚地看到关键的木质素侧链轮廓，盒装木质素侧链区域被垂直缩放了1.75倍。
4.酶预处理促进糖化
为了研究用P. putredinis NO1氧化酶预处理麦秸是否会提高糖化率，我们在添加商业纤维素酶之前将麦秸与酶一起培养16小时，观察到与单独使用缓冲液处理的麦秸相比，葡萄糖释放水平增加了20%(方差分析，F(2,12) = 4.47，P< 0.05)(图4B)。
木质纤维素以作物残留物的形式为可再生燃料和化学品的生产提供了一种极具吸引力的原油替代品。然而，它作为一种原料的大规模应用仍然有限。其实现的其中一个瓶颈是木质素的存在，木质素包裹着结构，物理上阻碍了通往下面富含糖的聚合物的通道。在本研究这种特殊的木质纤维素降解真菌的分离中，这种真菌产生新的氧化酶活性，不需要辅助因子。这种酶从木质素大分子中切割释放木质素的tricin(一种具有药用潜力的类黄酮)中的β-醚单位。此外，我们证明用这种酶处理可以增加木质纤维素生物质的消化率，提供了从木质素生产有价值产品的可能性，同时降低了加工成本。
论文信息
原名：A multi-omics approach to lignocellulolytic enzyme discovery reveals a new ligninase activity from Parascedosporium putredinis NO1
译名：木质纤维素水解酶的多组学研究揭示了一种源自于P. putredinis NO1菌株所产生的新型木质素酶活性
期刊：PNAS
DOI：10.1073/pnas.2008888118
发表时间：2021.4.26
通讯作者：Nicola C. Oates
通讯作者单位：约克大学生物系新型农产品研究中心
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