长寿老人的CD4+T更高

以及最近与年龄相关的表达颗粒酶 K ( GZMK ) 的 CD8+ T 细胞的扩增。

此外，随着衰老，观察到炎症促进细胞群的增加，例如自然杀伤细胞和骨髓细胞（例如，单核细胞），

与这些人群的基因表达变化同时发生。

人类衰老过程的极端是极长寿 (EL)，其特征是存活超过同龄人不到 1% 的年龄。

EL 通常（但并非总是）与残疾的显着延迟和大多数（约 60%）常见的衰老相关疾病相关。

免疫细胞的变化被认为是衰老的标志之一，人们越来越认识到控制炎症的免疫能力丧失和免疫应激源的反弹是限制年龄的疾病进展的核心。

由于百岁老人——至少活到 100 岁的人——似乎衰老速度较慢，

表征这些精英个体的免疫细胞库可能指向促进 EL 的重要机制。

最近一项使用外周血单核细胞 (PBMC) 单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 的研究显示淋巴细胞和骨髓细胞分布发生变化，并且在至少活到 105 岁的个体中细胞毒性 CD4 + T 细胞显着增加年与年轻人相比。

桥本的研究集中在一群日本人身上，

因此，尚不清楚这些结果是否适用于其他种族。此外，该研究没有对这些细胞类型中发生的转录变化进行广泛表征，即表达水平随年龄和 EL 的变化。

在这项研究中，我们采用多模式方法，将单细胞转录组学与细胞表面蛋白分析相结合，以表征百岁老人外周免疫系统的组成和转录谱。我们将一个新的百岁老人单细胞数据集与多种公开可用的衰老和长寿外周血 scRNA-seq 数据集进行协调，以了解整个人类寿命期间循环免疫细胞群的动态，特别是在 EL 中.

方法

实验步骤

百岁老人于 2019 年在北美入组。该研究获得了波士顿医学中心和波士顿大学医学院 IRB 的批准，所有参与者均提供了书面知情同意书。我们简要概述了总体方法，以及有关人类受试者招募、血样采集和处理、PBMC 的 CITE-seq 和流式细胞术分析以及补充材料中所有统计方法的详细信息和方法。

单细胞分析

百岁老人的CITE-seq数据

使用基于液滴的商业平台 (10x Chromium) 对 7 名百岁老人和 2 名年轻人进行了细胞索引和表位测序 (CITE-seq)。补充材料中提供了预处理数据、过滤、PCA 分析、批量校正、聚类和细胞类型识别的详细方法。

老化和 EL 数据集的协调

我们使用 Harmony 算法将来自 NECS 的百岁老人的 CITE-seq 数据与公开可用的 scRNA-seq 数据集相协调

对人类寿命的四个年龄组进行综合分析（补充表 S3）。为了避免对年龄模式（例如线性）的假设，我们通过将受试者分为四个近似的、基于分位数的年龄组来确定集成数据集中的四个年龄组（补充表 S3 ）。

整体细胞类型分布的异质性

我们计算了一个标准化的基于熵的度量

描述每个样本的所有细胞类型比例的异质性。该指标在具有更多异质（均匀）细胞类型比例的样本中较高，而在特定细胞类型更丰富的样本中较低。

年龄和性别对细胞类型分布的影响

我们使用贝叶斯多项回归模型分析了年龄和性别对受试者水平所有 13 种细胞类型比例的影响。

外周免疫区室层次结构分析

我们使用了 K2Taxonomer (v1.0.5)

根据转录组学概况的相对相似性对细胞类型进行自上而下的划分，并生成外周免疫区室的数据驱动层次结构。在层次结构的每个级别中，我们使用 p 值阈值为 0.05 的方差分析测试了年龄组之间细胞类型多样性统计差异的显着性。

细胞类型模式的验证

我们使用光谱流式细胞术面板计算了 NECS 样本的细胞类型比例，该面板包括所有已识别群体的特定标记。我们将这些新数据与先前作为跨多个年龄组的免疫监测研究的一部分发布的质谱流式细胞术数据集相结合。

细胞类型特异性差异基因表达分析

为了研究不同年龄组的细胞类型特异性差异，我们使用按性别、种族、数据批次调整的年龄贝叶斯混合效应回归模型分析了对数归一化基因表达丰度。我们包括了一个随机效应来解释将细胞分组到受试者中的原因。我们根据 Benjamin 和 Hochberg 校正计算了每个年龄组比较的 FDR，用于对所有测试基因进行多次测试。我们根据 FDR < 0.05 和至少 10% 的倍数变化 (FC) 选择了显着不同的基因。

批量水平差异基因表达分析

我们使用 DESeq2 在年龄组之间的整体水平上进行了差异基因表达分析

在至少 50% 的最小细胞类型群体中表达的基因。根据至少 50% 的倍数变化和 FDR < 0.05 评估大量水平的重要基因。

资金来源的作用

没有资金来源在研究设计、数据收集、数据分析、解释、报告撰写和提交论文发表的决定中发挥任何作用。

结果

单细胞分辨率下百岁老人的外周免疫景观

使用 10X Genomics 平台进行基于液滴的转录组细胞索引和表位测序 (CITE-seq)，

我们同时分析了 7 名百岁老人（100-119 岁）和两名没有已知家族长寿史的年轻个体（20-59 岁）的 16,082 个 PBMC 的全转录组表达和 10 标记细胞表面水平蛋白表达). 所有九名受试者都是欧洲人后裔，来自新英格兰百岁老人研究 (NECS)，平均样本捕获量为 1833 个细胞（表 1）。我们考虑了技术差异并使用 Harmony 整合了多个样本

（补充图 S1）。然后，我们执行基于 Louvain 图的聚类，将细胞分组为具有相似表达谱的群体，并使用均匀流形近似和投影 (UMAP)

的细胞表达谱，以可视化二维空间中的单个细胞。

表 1本研究纳入的 7 位百岁老人人口学特征表。

样品编号年龄范围性别

EL1100–105男性

EL2105+女性

EL3105+女性

EL4100–105女性

EL5105+男性

EL6105+男性

EL7100–105女性

YA144男性

YA234女性

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我们利用 10 种免疫细胞表面蛋白表达标记物来鉴定主要的淋巴细胞和骨髓细胞类型（补充图 S2，补充表 S1），随后以转录免疫细胞特征为特征的亚型先前在人外周血中具有特征

和胎肝

（补充图 S3–S7，补充表 S2）。这种方法确定了 11 种免疫细胞类型，其中包括主要淋巴细胞群：CD4 + T 细胞 (CD4TC) 具有非细胞毒性幼稚和记忆亚型 (nCD4TC、mCD4TC) 和细胞毒性亚型 (cCD4TC)，CD8 + T 细胞 (CD8TC) 具有细胞毒性亚型 (cCD8TC) )、具有初始和记忆亚型（nBC 和 mBC）的 B 细胞 (BC) 和自然杀伤细胞 (NK)（补充图 S2 和 S3）。此外，我们确定了主要的髓系细胞群：具有 CD14 +和 CD16 +亚型（M14 和 M16）的单核细胞以及具有髓系和浆细胞亚型（mDC 和 pDC）的树突状细胞 (DC)（补充图 S2 和 S3）。

与较年轻的年龄组相比，百岁老人的免疫细胞库发生了变化

为了表征整个人类生命周期中的外周免疫细胞类型组成和基因表达谱，我们将我们的数据与两个公开可用的衰老和长寿 PBMC 数据集整合，其中包括欧洲和日本血统的受试者

（图 1 A 和 B，补充图 S8）。这些数据集与我们新颖的 NECs 数据集的整合产生了来自四个年龄组的 66 个个体的总共 102,284 个细胞：12 个较年轻的受试者（20-39 岁），26 个中年受试者（40-59 岁），14 个受试者年龄较大（60-89 岁）和 14 名 EL 受试者（100-119 岁）（补充表 S3 和 S4）。使用 Harmony 解决了数据集之间的技术差异。

该分析确定了另外两种细胞类型：浆 B 细胞 (pBC) 和 γδ T 细胞 (gdTC)，数据集中共有 13 种细胞类型（图 1 B）。

图 1在单细胞分辨率下来自极长寿受试者的外周血细胞的免疫景观。 A.来自综合 scRNA-seq 数据集（NECS、PNAS 和 NATGEN，由已识别的免疫细胞亚型标记）的代表人类寿命的所有 66 个受试者的 PBMC 的 UMAP 嵌入。B. 来自所有 66 个受试者的 PBMC 的 UMAP嵌入代表来自集成 scRNA-seq 数据集（NECS、PNAS 和 NATGEN，按四个年龄组标记）的人类寿命。

图 2A显示了 66 名受试者中观察到的 13 种免疫细胞类型的比例，按年龄分层。值得注意的是，EL 组的特点是骨髓细胞比例增加和淋巴细胞比例减少：三个较年轻的年龄组（20-89 岁）的骨髓细胞与淋巴细胞的比例约为 13.8/86.2%并在 EL 组中转移到 25.2/74.8%（图 2 A，补充表 S5）。骨髓细胞和淋巴细胞的这种转变是衰老的预期趋势。

图 2A中的条形图表明 13 种免疫细胞类型的比例分布在 EL 组中变得更加均匀。为了形式化这一观察，我们接下来计算了每个样本的细胞类型多样性统计数据。

这个统计量本质上是一个基于熵的分数，我们引入它来总结样本中细胞类型比例的向量。分数在 -1 和 0 之间归一化，-1 对应于存在单个细胞类型的情况，0 对应于所有细胞类型以完全相同的比例存在并因此更均匀的情况。对 13 个免疫群体的分析显示，与较年轻的年龄组相比，EL 中的细胞类型多样性统计数据有增加的趋势，尽管这种差异在统计学上不显着（F 检验，p 值 = 0.7231）（补充图S9） . 当 nCD4TC 和 mCD4TC 结合为非细胞毒性 CD4 +T 细胞，与较年轻的年龄相比，EL 中细胞类型多样性统计的增加具有统计学意义（F 检验，p 值 = 0.0001875）（图 2 B，补充表 S6）。该分析形式化了 EL 受试者中 PBMC 的组成变得更加异质的观察结果。

图 2极长寿表明与较年轻的年龄组相比，免疫细胞库发生了变化。 A.跨集成 scRNA-seq 数据集的每个样本的淋巴细胞和骨髓免疫细胞亚型相对比例的条形图：年轻、中年、老年和 EL。B. 12 种免疫细胞亚型的受试者特定细胞类型多样性统计的箱线图，按年龄组分组（F 检验 p 值 = 0.0001875）。C。每个年龄组中淋巴细胞和骨髓免疫细胞亚型的估计比例的条形图，分别针对男性和女性分组。使用贝叶斯多项式回归模型估计比例，每个样本平均 1833 个细胞使我们能够以 95% 的置信度估计最小比例 0.3%。D.比较中年、老年和 EL 年龄组与较年轻年龄组（右）的年龄系数热图，以及比较女性与男性的每种细胞类型的性别系数热图。我们计算了每个系数的 Z 统计量和显着性 p 值，表示为：*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

为了按年龄和性别估计细胞类型的比例，我们接下来使用贝叶斯多项回归分析了所有 66 名受试者观察到的细胞类型比例（参见方法，补充表S7-S10）。该分析对四个年龄组的 13 种细胞类型的比例进行了年龄和性别特异性估计（图 2 C 和 D）。估计表明，根据免疫细胞在不同年龄和 EL 的分布，主要分为三组：1) 其比例随年龄和 EL（老化相关）单调增加或减少的细胞类型，2) 其比例增加或增加的细胞类型只减少在 EL 组（EL 特定）中，3) 比例随年龄增加或减少的细胞类型，但这些变化不会在 EL 组（老化特定）中继续。

我们在 cCD4TC、gdTC 和 M14 群体中观察到与衰老相关的变化（即衰老和 EL 的变化）。cCD4TC 的估计比例随着年龄的增长而稳步增加，占 EL 男性 PBMC 的 7.5% 和 EL 女性 PBMC 的 6.0%，而年轻年龄组的 PBMC 不到 1%（图 2 C 和D） ). 与年轻人相比，百岁老人的 cCD4TC 显着变化与之前的发现一致。

我们在 gdTC 和 M14 的估计比例中观察到类似的与衰老相关的变化（图 2 C 和 D）。

观察到五个淋巴细胞和骨髓细胞群具有 EL 特异性变化（即，仅在 EL 中发生变化），包括 nCD4TC、mCD4TC、pBC、mDC 和 pDC。EL 中 nCD4TC 和 mCD4TC 的较低频率是已知的。

然而，与较年轻组的男性 1.3% 和女性 1.1% 相比，男性 EL 和女性 PBMC 的 mDC 比例估计较低，分别为 0.9% 和 EL 的 0.7%（图 1）。 . 2 C和D）。此外，我们在 nBC、mBC 和 M16 人群中观察到了特定于衰老的变化（即，衰老的变化而非 EL）。nBC 的估计比例显着增加至老年组男性 PBMCs 的 6.2% 和女性 PBMCs 的 11.3%，而年轻组男性 PBMCs 的比例为 1.5%，女性 PBMCs 的比例为 2.9%（图 2 ） C 和 D）。然而，EL 中 nBC 的 PBMC 的估计比例在男性中为 0.9%，在女性中为 1.7%（图 2 C 和 D）。

此外，我们发现在 nCD4TC、cCD4TC、cCD8TC、gdTC、nBC、NK 和 M14（补充表 S11）中，与 EL 相比，老年人的组成发生了显着变化。例如，我们发现与 EL 相比，老年人的 cCD4TC 比例显着降低，这与我们在老年人和 EL 年龄组中观察到的 cCD4TC 比例与年轻年龄组相比增加一致（补充表 S11 ）。

通过一起检查所有 13 种细胞类型的比例，我们强调了百岁老人 PBMC 整体构成的主要差异，并显示随着年龄的增长从先天性细胞类型到适应性细胞类型的重大转变。

与较年轻的年龄组相比，极长寿表明淋巴细胞和骨髓细胞群的免疫弹性策略发生了转变

为了研究免疫区内的构成是否也随着年龄和 EL 发生变化，以及是否可能影响它们的生物学功能和免疫弹性策略，我们接下来检查了它们的骨髓和淋巴细胞谱系中各种免疫细胞类型的构成。为此，我们基于使用 K2Taxonomer 的免疫细胞类型的基因表达谱，生成了外周免疫区室、分区细胞类型的层次结构，

然后计算层次结构的每个级别中细胞类型的平均比例（参见方法）（补充表 S12 和 S13）。图 3显示了该分析的结果，并揭示了与年轻年龄组相比，EL 组中骨髓和淋巴细胞区室组成的具体变化。此外，我们使用流式细胞术生成了 NECS 受试者中大部分相同细胞计数的独立估计，并将数据与 Alpert 等人公开可用的质谱细胞术数据整合。

其中包括 39 名年轻人（平均年龄 = 29 岁）和 50 名老年人（平均年龄 = 80 岁）。补充图 S11将基于细胞计数数据集的细胞类型的年龄趋势与基于 scRNA-seq 数据的原始分析进行了对比。我们接下来讨论选定的结果，完整的分析在补充表 S14-S26中提供。

图 3百岁老人淋巴细胞和骨髓细胞群免疫恢复策略的转变。人类寿命四个年龄组的平均免疫细胞类型比例沿外周免疫区室的等级：PBMC（髓样与淋巴）、髓样（Mono 与 DC）、淋巴（NonCyt 与 Cyt）、DC（mDC） v. pDC)、Mono (M14 v. M16)、NonCyt (CD4TC v. BC)、Cyt (Cyt1 v. Cyt2)、Cyt1 (gdTC v. NK)、Cyt2 (cCD4TC v. cCD8TC) 和 CD4TC (nCD4TC v. . mCD4TC) 和 BC (nBC 诉 mBC)。

层次结构的顶部概括了在前面讨论的百岁老人的 PBMC 中观察到的明显更大比例的骨髓细胞 (Myeloid) 和更小比例的淋巴细胞 (Lymph)。淋巴细胞的减少通过对来自 NECS 的 7 名百岁老人和 3 名年轻人以及来自 Alpert 等人的 39 名年轻人和 50 名老年人的流式细胞术分析得到验证。

（补充图 S11，补充表 S26）。Myeloid compartment（图 3中树的左侧分支）的分析表明，与在所有其他年龄组中观察到较低比例的 Mono 和较高比例的 DC（Mono 与 DC 比率为 85.59%/14.41%）。两种分布的差异具有统计学意义，（细胞类型多样性统计的 F 检验，p 值 = 0.0001315）（图 3，补充图 S10）。我们根据细胞计数法测量的 EL 和来自 NECS 的年轻个体的比例，观察到 EL 中 Mono 与 DC 相比有所增加（补充图 S11，补充表 S26）。这种 DC 成分的变化以前没有报道过。

尽管在 Mono 和 DC 中没有检测到其他变化，但我们观察到在 Mono 和 DC 中通过流式细胞术测量的不同年龄的细胞比例有相似趋势（补充图 S11，补充表 S26）。

对淋巴细胞区室（图 3中树的右分支）的分析表明，与较年轻的年龄组（Cyt：30.30 % 和 NonCyt：69.70%）。这种分布差异在我们的分析中仅具有临界统计显着性（细胞类型多样性统计的 F 检验，p 值 = 0.05032），但与其他研究人员报告的结果一致。

2个

此外，层次结构显示了在百岁老人中具有独特组成的 Cyt 和 NonCyt 的进一步子类型。例如，与所有较年轻的年龄组（CD4TC：90.86% 和 BC：9.41%，F 检验，p 值）相比，百岁老人的 NonCyt 的 CD4TC 比例 (81.55%) 和 BC 比例显着较低 (18.45%) = 0.003313)（图 3，补充图 S10）。根据流式细胞术测量的比例，我们观察到 EL 中的 CD4TC 和 BC 与来自 NECS 的年轻个体相比有类似的变化，但在来自 Alpert 等人的年轻和年长个体中没有观察到。

（补充图 S11，补充表 S26）。在以前的研究中，据报道，非细胞毒性 CD4TC 和 BC 都会在长寿个体的 PBMC 中减少，

但是这两种细胞类型之间的这种转变以前没有被观察到。

与所有较年轻的年龄组相比，百岁老人 CD4TC 的组成特征是 mCD4TC (65.72%) 增加和 nCD4TC (34.28%) 减少（mCD4TC：39.46% 和 nCD4TC：60.54%，F 检验，p 值= 0.02852)（图 3，补充图 S10）。EL 组中 BC 的组成也有类似的变化，从原始细胞 (nBC: 41.06%) 到记忆细胞 (mBC: 58.94%)，但变化没有达到统计学显着性（F 检验，p 值 = 0.7168）（图3、补充图S10）。此外，我们基于流式细胞术分析观察到 EL 和 NECS 年轻个体之间 nBC 和 mBC 之间的类似变化（补充图 S11，补充表 S26）。

总之，使用外周免疫区室的层次结构，我们确定了百岁老人 PBMC 的构成与年轻一代相比在骨髓和淋巴细胞谱系中的主要变化，这些谱系在所有 13 种细胞类型方面都被全球掩盖。

百岁老人显示出与极长寿相关的独特转录谱

前两项分析根据各种细胞类型的比例，对全球百岁 PBMC 及其骨髓和淋巴细胞谱系的构成进行了表征。接下来，我们检查了他们相对于较年轻年龄组的表达谱。对于每种细胞类型，我们进行了一项分析以发现具有差异表达的基因作为年龄和/或 EL 的函数，该分析确定了至少在一种细胞类型中具有年龄或 EL 相关差异表达的 151 个基因（图 4 ，补充）表 S27 )。显着差异表达基因的数量因细胞类型和比较组而异（图4A）：平均而言，中等细胞类型与比较组的细胞类型表达谱比较. 与老年组相比，年轻组产生的差异表达基因数量较少（即差异较少）。更小的年龄和 EL vs. 较年轻的年龄组。图 4 B 显示了每个年龄组比较中所有细胞类型特异性特征的明显差异基因表达模式。在这些特定于细胞类型的特征中，我们确定了 20 个差异基因，这些基因先前已在 PBMC 衰老的转录研究中被确定为随年龄而变化，

包括富含亮氨酸的重复神经元蛋白 3 ( LRRN3 )、淋巴增强结合因子-1 ( LEF1 ) 和组织蛋白酶 H ( CTSH )。

图 4细胞类型基因表达变化展示了人类生命周期中的三种模式。 A.老化比较中显着差异表达基因的数量表：中年与年轻、年长与年轻、EL 与年轻基于最小 10% 变化的倍数变化阈值和 FDR 小于 0.05。B.按年龄组分组的所有细胞类型中所有重要基因的每个样本的缩放平均表达热图。C.特定细胞类型中特定重要基因表达水平的箱线图显示衰老和 EL（衰老相关）的变化至少具有名义意义，D. 仅在EL（EL-特异性）中发生变化，E.老化的变化不在 EL（特定老化）中。*p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.001。

对年龄特异性表达变化的进一步检查确定了图 4 C-E中总结的三种主要模式，并密切反映了上述细胞类型组成的变化。这些模式包括 1) 其表达随年龄单调增加或减少的基因和至少具有名义意义的 EL（老化相关），2) 其表达仅在EL组（EL-特定）中增加或减少的基因，3) 基因其表达随着年龄的增长而增加或减少，但这些变化不会在 EL 组（特定老化）中继续存在。

我们确定了 35 个具有衰老相关模式（即衰老和 EL 的变化）的基因，这些基因在各种免疫细胞类型中具有差异表达。图 4 C 显示了第一组基因的选定示例，补充图 S12-S20包括更多示例。该组包括参与 DNA 损伤反应的基因，例如nCD4TC 中的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 17A ( STK17A )（图 4C）。STK17A是细胞凋亡的正调节因子，之前曾报道STK17A附近的变体与 WGS 分析中的长寿有关。

此外，先前已确定STK17A在 PBMC 的 T 细胞中发生年龄变化。

此外，先前报道的两个基因在外周血中随着年龄的增长而表达增加

包括在 T 细胞中

属于第 1 组： nCD4TC 中的LRRN3和LEF1（图 4 C）。

我们在几种细胞类型中鉴定了 25 个具有 EL 特异性模式（即，仅在 EL 中发生变化）的基因（图 4D，补充图 S12-S20）。图 4D显示了似乎仅在 EL 组的免疫细胞中表达的基因示例。仅在 EL 组的 nCD4TC 中表达的基因的一个例子是 S100 蛋白编码基因S100A4（图 4D）。S100 蛋白与衰老相关疾病（如阿尔茨海默病）以及长寿有关。

此外，S100A4之前曾与 PBMC T 细胞的年龄相关变化有关。

第 2 组还包括mCD4TC（图 4D）和 cCD8TC（补充图 S14 ）中的HLA II 类组织相容性抗原基因HLA-DPA1 ，以及NK（图 4D）和 mDC（补充图）中的干扰素诱导的跨膜蛋白IFITM3图 S18）和cCD8TC 中的IFITM2（补充图 S12）。这些主要的组织相容性和干扰素相关基因参与抗原呈递和免疫反应通路的激活。

我们确定了 26 个具有衰老特异性模式的基因（即，衰老发生变化但 EL 没有变化），其表达水平随年龄而变化，但在 EL 中在各种细胞群中没有变化。图 4 E 显示了 3 个基因的示例，其他示例在补充图 S12-S20中。该组包括响应氧化应激的基因，包括nCD4TC（图 4 E）和 mCD4TC（补充图 S13 ）中的 sestrin 3（ SESN3 ）、 nBC 中的argonaute RISC 催化组分 3（AGO3 ）和细胞色素 C 氧化酶组装因子（ COX16 ））在 mBC 中（图 4 E）。SESN3 是应激诱导代谢蛋白 sestrin 家族的一部分，并受到FOXO3氧化应激/损伤的刺激，FOXO3 是一种与长寿相关的转录因子，

而AGO3是 argonaute (AGO) 蛋白家族的一部分，该蛋白先前与衰老和氧化应激诱导的衰老有关。

此外，我们在老年人和 EL 年龄组之间发现了 62 个显着的细胞类型特异性差异基因，包括S100A4，与 nCD4TC 中的 EL 相比，S100A4 在老年人中显着降低（补充表 S28）。这与 EL 与较年轻年龄相比观察到的显着增加是一致的（图 4 D）。此外，我们检查了女性和男性之间的基因表达变化。与跨细胞类型的男性相比，我们在女性之间检测到 28 个显着差异基因（图 4 A，补充表 S27）). 在这 28 个基因中，有 6 个基因在大多数或所有细胞类型中差异表达。这组基因包括X染色体和Y染色体连锁基因，如核糖体蛋白S4 X连锁（RPS4X）、X失活特异性转录本（XIST）和真核翻译起始因子1A X连锁（EIF1AX）、核糖体蛋白S4 Y 连锁 ( RPS4Y1 )、DEAD-box 解旋酶 3 Y 连锁 ( DDX3Y ) 和真核翻译起始因子 1A Y 连锁 ( EIF1AY )（补充表 S27）。除了EIF1AX, 这些基因先前已被报道在 PBMC 中具有基于跨免疫细胞类型的性别的基因表达差异。

此外，参与 T 细胞活化和促炎机制的CD99 ，

女性 nCD4TC 的表达显着低于男性。

除了细胞类型特异性表达谱外，我们还分析了在不同细胞类型上聚集的基因表达（见方法）。与中年组和年轻组（0 个基因）和老年组和年轻组（3 个基因）相比，该分析确定了在 EL 与年轻组比较（387 个基因）中表达显着不同的基因数量更多（补充图 S21，补充表 S29）。在 EL v. 较年轻组中鉴定的 387 个显着差异基因中，我们发现与较年轻组相比，EL 组中有 136 个基因过度表达和 251 个基因表达不足（补充图 S21，补充表S29 ）). 此外，在 EL v. 较年轻时鉴定的 387 个重要基因中，我们鉴定了 164 个先前鉴定为表达随年龄变化的基因

包括LEF1和LRRN3

我们还在单细胞水平以及CD28抗原分子上进行了鉴定。

讨论

主要结果概述

我们使用多模式、单细胞方法，使用 CITE-seq 从 7 名百岁老人的 PBMC 生成细胞组成和转录谱。我们将这一新颖的数据集与公开可用的人类寿命老化和长寿的 scRNA-seq 数据集相结合，以表征百岁老人独有的细胞类型组成和基因表达谱。我们观察到免疫细胞的组成随年龄发生显着变化，包括骨髓细胞类型的新变化：M14、M16、mDC 和 pDC。我们还对外周免疫区室的数据驱动层次结构进行了一项新的分析，揭示了百岁老人 T 细胞和 B 细胞组成的以前未检测到的变化，我们使用正交方法（流式细胞术）验证了其中的几个变化。基于基因表达变化，

基于 PBMC 种群总数的细胞类型组成概况

众所周知，个体的外周血免疫细胞库会随着年龄的增长而变化。

先前的转录研究表明，随着年龄的增长，淋巴细胞减少，骨髓细胞增加，

我们也在百岁老人的外周血中观察到了这一点（图2）。然而，除了衰老过程中的这些常见变化外，我们的分析还确定了百岁老人独有的免疫细胞谱和成分改变模式。我们观察到百岁老人 PBMC 的组成从非细胞毒性（例如，nCD4TC 和 mCD4TC）到细胞毒性淋巴细胞（例如，cCD4TC）的预期变化，这在之前的人类长寿研究中已经观察到。

同样，先前也报道了随着衰老和长寿而减少的 nBC。

然而，我们还发现了极端老年的新组成模式，包括与衰老相关的变化（例如，在 EL 组中持续的老年 M14 的显着增加）、EL 特定变化（例如，mDC 和 pDC 在 EL 组中没有显示显着变化）三个较年轻的年龄组，但 EL 出现独特的显着下降），以及与 EL 无关的老化特异性变化（例如，M16 在较大年龄组中显着增加，然后在 EL 年龄组中减少）（图2). 百岁老人身上的这些独特模式在多大程度上是极长寿命的驱动因素，或者只是达到极老年龄的结果，这仍然是一个悬而未决的问题，因为并非我们在百岁老人身上看到的一切都对达到极老年龄很重要。需要更多数据来了解这些模式对人类寿命的影响。

外周细胞隔室内的细胞类型组成概况

利用基于 PBMC 群体总数表征细胞类型组成概况的传统方法，我们确定了极端老年的新组成变化（图 2）。然而，这种分析对淋巴细胞和骨髓细胞内免疫细胞类型变化的了解有限。我们使用了一种新的数据驱动方法来创建外周免疫区室的层次结构。图 3中总结的分析显示，例如，与年轻年龄组相比，百岁老人的 PBMC 中淋巴细胞的比例有所降低，但成分也发生了显着变化。具体而言，百岁老人淋巴细胞的特点是 NonCyt 减少了近 50%，这些淋巴细胞变得富含 BC，而 BC 本身又富含 mBC。值得注意的是，CD4TC 和 BC 在免疫系统对感染的反应中具有重要作用。

BC 与抗体介导的免疫反应相关，可触发对病原体的快速反应，而 T 淋巴细胞（如 CD4TC）与以较慢速度发展的细胞介导免疫相关。研究还发现了 BC 和 CD4TC 之间的串扰，表明它们在保护性免疫反应中相互依赖。

从 CD4TC 到 BC 的转变表明百岁老人对感染产生了更直接的免疫反应。我们还观察到 CD4TC 内从幼稚亚型到记忆亚型的显着转变，并且在某种程度上，在 BC 内，这表明百岁老人没有逃脱感染，而是经历了更多的感染暴露，并且能够对它们产生强烈的反应。先前的研究还表明，控制炎症的能力和保持免疫能力与长寿之间的关联是一种免疫弹性表型。

我们在百岁老人身上观察到的独特免疫细胞构成可能代表了他们免疫系统的适应或对关键免疫细胞类型丧失的补偿机制。有趣的是，在图 3中显示的几乎所有隔室中，EL 组的特征是与年轻年龄组相比，细胞类型的偏斜分布较小。免疫细胞分布更加异质可能是其免疫弹性的驱动因素。组成异质性可能将免疫能力反映为动态平衡或体内平衡。

相反，免疫失衡通常是对感染反应不佳的特征（例如，COVID-19

) 或通过不太有效或耗尽的细胞介质 (例如, NK 细胞) 进行补偿

) 损害健康跨度。

基因表达谱

我们的分析确定了三种与年龄相关的变化模式：整个生命周期的单调变化、EL 组中不存在的与年龄相关的变化以及百岁老人独有的变化。有趣的是，我们在百岁老人的血清蛋白质组中注意到了类似的模式。

通过比较百岁老人和七十多岁老人的血清蛋白质组，我们发现了与衰老相关的蛋白质特征以及百岁老人独有的蛋白质特征。我们还发现了一种特定年龄的蛋白质特征，这种特征在百岁老人中没有像预期的那样延长。如果没有百岁老人年轻时血液表达谱的额外数据，我们无法确定这些 EL 特定模式是人类极度长寿的驱动因素还是极度衰老的影响。然而，一些在 EL 组中具有差异表达的基因已与衰老和长寿研究相关联。例如，我们发现与 nCD4TC 中的年龄相关的STK17A变体的表达（图 4C）在百岁老人中更高。

STK17A参与 DNA 损伤反应、细胞凋亡的正调节以及活性氧 (ROS) 的线粒体和代谢调节。这种关联与之前将 DNA 损伤修复机制与衰老和长寿相关联的研究结果一致。

S100A4是钙结合蛋白 S100 家族的一部分，在 nCD4TC 中显示出 EL 特异性变化（图 4D）。S100 蛋白（如S100A13）与它们在长寿中的作用有关，包括与百岁老人的APOE基因型有关。

此外，S100 蛋白家族与大脑中与衰老相关疾病（如阿尔茨海默病）相关的炎症通路有关。

在 CD4 + T 细胞中，发现S100A4在老年小鼠中的表达高于年轻小鼠，并参与炎症和激活。

最近的一项研究发现，S100 蛋白通过线粒体代谢调节和功能成为造血干细胞更新的关键调节剂。

在大鼠中，重组S100A4表现出响应氧化应激损伤的抗细胞凋亡功能。

我们在分析中发现的其他转录特征，例如SESN3和AGO3（图 4 E），参与 DNA 损伤反应以及响应氧化应激而激活的线粒体和代谢调节。

SESN3等 Sestrins是高度保守的应激诱导蛋白，可保护免疫系统应对 DNA 损伤和氧化应激。

更具体地说， SESN3响应氧化损伤的诱导被FOXO3激活，

与长寿相关的转录因子。

AGO3是参与 miRNA 结合和稳定性的 AGO 蛋白家族的一部分，与氧化应激诱导的衰老和衰老有关。

在免疫系统中，线粒体调节在免疫细胞转录和激活中发挥作用

48岁

并可能促进长寿。

此外，线粒体质量和活性的下降与衰老和衰老有关。

48岁

与线粒体和代谢调节的联系表明，百岁老人可能在线粒体和代谢调节和功能方面发生了变化，应该进一步研究。我们注意到，我们从“伪批量”数据中得出的老化特征与之前发布的从批量数据中得出的老化特征非常匹配