小L生信日记
嗨，大家好，我是小L。
小L又来啦~上次已经学过了“生信必知背景知识”，这次就要开始进行数据分析。
先了解一下我们分析的数据是怎么来的，二代测序的流程可以简单总结为：核酸抽提——文库构建——测序——数据分析，而我们分析的对象就是“测序”获得的下机数据。
但是，测序下机得到的原始数据怎么样？是否合格？是否能够进行后续分析？
我们要通过质量评估（Quality Control，QC）来查看原始reads的质量，常用的工具就是FastQC（网址：http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/），下载之后按照提示安装即可。
软件对原始数据质检完成之后，会自动保存在文件夹内。直接打开HTML格式的结果报告，左侧会显示出内容质检内容总览：
结果分为：绿色表示“PASS（通过）”，红色表示“FAIL（未通过）”，黄色表示“WARN（警告，不太好）”
接下来的内容，小L记录的比较详细，因为小L觉得这样的方式便于理解，也适合回看，方便查找。
当然，如果只想学会看懂图形好坏的话，可以忽略“横纵坐标及解释”，直接看“图形判断”。图形判断部分内容也分为两部分：一个是软件系统判断标准，这个了解即可；第二部分比较常用，给出了简单判断图形好坏的标准，并给出了反例。
1.Basic Statistics（基本统计信息）
basic statistics会显示出原始数据的一些基本信息：文件名称、文件类型、编码方式（测序平台）、序列总数量、标记为低质量的序列数、序列长度、GC含量。（大家可以记住图中红框内的信息，后面的讲解有引用。）
对于基本信息，没有什么好判断的，所以Basic Statistics从不提出警告。
2.Per base sequence quality
（单碱基序列质量）
横轴：序列上各位置的碱基（1-150，共150个碱基）
纵轴：碱基质量（quality），以质量分数（Quality score）作为量度。Quality score =-10log10p，p为错误率
解释：上图表示，对该文件中的29409041条序列上每个位置的碱基进行质量检测，得到各个位置碱基的质量情况。对于每个位置，绘制BoxWhisker图，主要参数如下：
红色横线：中位数
蓝色折线：平均数的连线
亮黄色方框：四分位25~75%的区间
黑色横线触须：10-90%区间
图形判断：
若任一位置的下四分位线（黄色区间底端）低于10或中位数低于25，报“WARN（黄色）”；若任一位置的下四分位线（黄色区间底端）低于5或中位数低于20，报“FAIL（红色）”
三色背景图按照质量分数分为三部分：绿色（碱基质量很好）、黄色（碱基质量一般）、红色（碱基质量差）。碱基的质量越高越好，一般要求纵坐标不低于20，即红色背景区域没有图形，比如上图。下图是一个反例：
3.per tile sequence quality
横轴：测序序列上150个碱基的位置
纵轴：测序小孔
解释：这一模块是检查在测序平台上，reads中每一个碱基位置在不同的测序小孔之间的偏离度，偏离度越高，碱基质量越差。
图中的tile是什么？这个说来话长，不如不讲。我们只需要了解它是Illumina测序设备中flow cell的一部分，通过查看per tile的质量得分，可以查看是否仅与flow cell的一部分相关联的质量损失。
图片判断：
系统判断：偏离度小于平均值2以上报"WARN(黄色，!)"，偏离度小于平均值5以上报"FAIL(红色，X)"。
图中颜色是从冷到热的比例，蓝色表示低于平均偏离度， 越红则说明偏离平均质量方差越多，也就是说质量越差。比较好的情况是像上图一样一片蓝色。下图是一个反例:
4.Per sequence quality scores
序列质量统计
横轴：序列的质量分数，Quality score = -10log10p，p为错误率，p为一条reads在某个位置出错的概率，当p为1%时，Q值=20。
纵轴：reads数目
解释：该图表示序列质量的分布情况，即有xx（纵坐标）条reads的质量分数（Q值）为xx（横坐标）。
图形判断：
软件会自行判断：当峰值小于27（错误率0.2%）时报 "WARN（黄色，！）"，当峰值小于20（错误率1%）时报" FAIL（红色，X）"。
一般情况下，90%的reads测序质量（Q值）在35分以上，就认为测序质量非常好。如上图，序列集中在最右端Q值较大的区域。下图是一个反例：中间有起峰，说明有一定量序列的Q值小于20。
5.Per base sequence content
碱基比例分布
横轴：序列上150个碱基的位置（1-150bp）
纵轴：ATCG四种碱基在每个位置上的含量百分比
解释：不同的碱基分别用不同的颜色表示。对所有reads的每一个位置，统计ATCG四种碱基（正常情况）的分布：理论上，如果建库足够均匀，reads的每个位置应当是没有差异的，A=T , C=G，且整个测序过程中稳定不变，四条线平行于X轴，反映样品（基因组、转录组等）的GC含量。但实际上，测序仪刚开始测序时状态不稳定，常会出现前几个碱基有较大波动的情况（如上图）。这种情况下，一般要去掉开头部分的序列信息。
图形判断：
软件判定标准：当任一位置的GC含量偏离均值的5%时，报"WARN"；当任一位置的GC含量偏离均值的10%时，报 "FAIL"。
比较好的图形是：A=T , C=G，且四条线平行于x轴。实际情况中，reads开头部分常会出现较大波动，软件一般都会判“WARN/FAIL”。
在 reads 开头出现碱基组成偏离往往是我们的建库操作造成的，比如建 GBS 文库时在 reads 开头加了 barcode；barcode 的碱基组成不是均一的，酶切位点的碱基组成是固定不变的，这样会造成明显的碱基组成偏离；在 reads 结尾出现的碱基组成偏离，往往是测序接头的污染造成的。
上图的前段情况不算特别好，但从第15个碱基开始，A=T , C=G，四条线平行于X轴，配合其他部分比较不错的结果，可以进行后续分析。下图是一个反例：A≠T ，四条线也不是平行于X轴的直线。
上面只放了质控内容的第五部分，剩下还有六部分放到下期里面讲。
（因为内容太长的话，你们也不爱看）
除了质控内容的剩余部分，下一期小L还会请生信部的小哥哥回复两个常会遇到的问题。请期待！
什么问题？下期见吧。
拜拜~ 新年快乐！
小L
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