两大热门技术的碰撞：CRISPR NGS

这份来自Illumina的《基因编辑研究综述》回顾了近期发表的一些文献，它们证明了Illumina测序技术在基因编辑研究中的应用。CRISPR和NGS，两大热门技术的碰撞究竟产生了什么火花？

规律间隔成簇短回文重复序列（CRISPR）-Cas技术是一种革命性的基因编辑方法，它利用可编程的RNA来指导核酸酶寻找基因组中的特定目标位置。这种简单的方法取代了之前那些繁琐又昂贵的DNA编辑技术，如基于蛋白质的锌指核酸酶（ZFN）或转录激活样效应因子核酸酶（TALEN）。

自从最初几篇介绍CRISPR-Cas技术在原核和真核细胞中的基因组编辑应用的文献发表以来，这种技术在全球实验室的应用呈指数级增长。 潜在的应用领域包括基础研究、治疗、农业和环境研究。

2016年，也就是基因编辑首次引入人体试验两年后，美国国立卫生研究院（NIH）首次批准了CRISPR-Cas9技术在人体试验中的应用。这项决策有望通过细胞替换，在未来实现罕见遗传病、人类免疫缺陷病毒（HIV）感染和恶性血液病的治疗。

CRISPR-Cas9系统来源于原核生物的适应性免疫系统，它靶定并切割噬菌体或质粒的入侵遗传元件。任何DNA编辑工具的效果和安全性都高度取决于特异性。一些研究发现，CRISPR-Cas9的使用可能导致意外的脱靶效应。基于这个原因，一些研究小组正在开发检测和降低脱靶效应的方法。

CRISPR位点以及CRISPR-Cas9技术的机制

细胞和古细菌在适应性免疫中使用CRISPR-Cas9系统。CRISPR位点由短回文重复序列组成，它们被称为“间隔序列”的非重复短序列隔开。间隔序列来源于入侵的DNA，如噬菌体，在感染发生时它们复制并掺入CRISPR位点。在这个位点附近，另一个位点则包含一套编码CRISPR相关的内切核酸酶（Cas）的基因，这种酶在基因组中引入切口。

当相同的入侵DNA重复感染时，RNA分子（CRISPR RNA或crRNA）将与Cas和反式激活crRNA（tracrRNA）形成复合物，指导核酸酶抵达外源序列所在之处。

Cas-RNA复合物将识别与crRNA互补并与特定的三核苷酸位点（前间区序列邻近基序或PAM）相邻的DNA目标。然后，复合物将切割和失活入侵的DNA（图1）。

图1. CRISPR位点由短回文重复序列组成，它们被称为“间隔序列”的非重复短序列隔开。间隔序列来源于入侵的DNA，如噬菌体，在感染发生时它们复制并掺入CRISPR位点。在这个位点附近，另一个位点则包含一套编码Cas内切核酸酶的基因，这种酶在基因组中引入切口。

尽管不同细菌内与CRISPR活性相关的核酸酶不同，但本综述中的大部分话题都围绕着化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），它依赖内切核酸酶Cas9。基于这个原因，本文主要指的是CRISPR-Cas9技术。

CRISPR-Cas9系统需要两种RNA分子：crRNA（从DNA间隔序列转录而来）和tracrRNA（它与crRNA的相互作用是招募Cas9所必需的结构）（图2）。在一项里程碑研究中，这两种RNA分子杂交形成单链向导RNA（sgRNA）。这种简化的Cas9-sgRNA系统证明了基因编辑的特性。

图2. 动画显示Cas9（透明）和sgRNA（红色）与DNA（蓝色）相互作用的分子结构

在哺乳动物细胞中，Cas9引入核酸酶诱导的双链断裂（DSB），它们可通过两种竞争性的修复机制中的一种来修复（图3）。第一种是非同源末端连接（NHEJ），它更常见但容易出错，这种修复带来插入和缺失突变（indel）。第二种是同源介导的修复（HDR），在供体DNA模板存在时，这种修复可实现精确的基因校正或插入。

图3. CRISPR-Cas9机制的示意图。Cas9搜索细胞的基因组内与20 bp的sgRNA匹配的序列。一旦发现，Cas9在匹配的序列中引入DSB。此时，两种通路将竞争性地修复引入的断裂：1) NHEJ以一种容易出错的机制修复末端，不需要同源模板，可产生小的插入和缺失。2) HDR机制需要同源序列来指导修复，可将供体模板插入序列中。