单阳管的设定标准是什么？罗工来告诉你
现在很多老师都知道光谱重叠会导致不同荧光通道间干扰，通过补偿调节可以将干扰信号减去，从而保证流式分析结果的正确。但是用来调补偿调节的单阳管很多同学不知道怎么设定 以及有哪些要求，这一期罗工将详细的给大家分享经验内容。
简单说，单阳管其实就是只加一种荧光抗体的样本管，比如你的样本有三种荧光抗体染色（FITC， PE， APC）。除了被检测样本外，另外还需要4个管子，一个是无染色的，一个是FITC阳性染色，一个是PE阳性染色，还有一个是APC阳性染色
在制备单染管时有哪些要求呢？
（1）、单染管和样本管的样本类型要保持一致，并且尽量选择处理的样本，保证有明显的阳性峰和阴性峰。
（2）、用来调节补偿的抗体必须与实验用的抗体荧光素一样。
（3）、单染管和样本管的操作方法要保持一致。例如检测胞内因子时，如果样本管进行了固定破膜，那么单染管即使是表面染色，也需要进行固定破膜。
（4）、单染管各个荧光通道的电压需与正式上样时的电压保持一直。
解释：荧光素的MFI值会因为电压的改变而改变，从而无法正确计算补偿值。
很多老师反馈说当marker丰度比较低时阳性群表达量低，很难准确区分阴阳性峰。特别是某些探索性实验。实验者本身不知道某些蛋白的表达情况，那这个时候应该怎么办呢？
我们可以选择用补偿微球代替细胞来制备单染管，商品化的补偿微球是聚苯乙烯微粒，用于优化荧光补偿设置。一般有阴性珠子和阳性珠子。充分混合后和抗体孵育，将得到阴性和阳性群比例一定的单染管。
补偿微球优点：（1）节省样本，不必使用有价值的细胞或者组织样本
（2）制备相对简单，大大减少工作量
（3）阴阳分群明显，避免了弱阳性样本信号不够强的问题。
分别使用肿瘤，脾脏和补偿微球制备的CD3单染管的分群现象
缺点：（1）有一些抗体无法用补偿微球进行染色。比如FVS系列死活染料就无法与补偿微球结合。（FVS染料与氨基结合）
（2）大多数情况下，用补偿微球计算的阴阳峰MFI相对值(Positve/negative)比样本管要大。
解释：补偿微球的阴性峰的MFI值在大多数情况下小于样本单染管，是因为补偿微球表面不会表达FcR受体，所以补偿微球的阴性珠子不会与抗体产生非特异性结合。但微球的阳性珠子和抗体结合后都会表现出强阳性，而这是一般生物样本无法达到的强度。如下图不同单染管在电压相同的情况下MFI值的差异。
那我们如果选择补偿微球制备单阳管时，又有哪些注意事项呢？
（1）使用要阴性和阳性珠子要混合均匀。
（2）补偿微球的直径颗粒度都小于大多数免疫细胞，如果阈值设置过大或者FSC/SSC电压过小，都会采集不到信号。如图为电压相同的情况下不同单染管的散点图。
（3）补偿微球上机时的电压应该按照其本身的电压设置，因为补偿微球的阳性峰都非常强，某些弱阳性实验样本的电压值套用到补偿微球上会让补偿微球的阳性峰（特别是PE这种比较亮的荧光素）超出动态范围。
（4）补偿微球不是能和所有的抗体结合，所以要依据抗体来源选择。
很多老师应该都提出过这样的疑问——单阳管是不是第一次建立模板时需要制备，后面实验就直接调用历史补偿呢？
如果Panel比较复杂是不推荐这样做的，因为调用历史补偿后都会存在过度补偿或者补偿不足的现象。特别是Panel超过十色的情况下。下图为调用历史补偿后的结果图。这种单通道补偿不准确的结果会不断累加，造成细胞群分布混乱。
那针对这种情况我们应该怎么改进呢?
（1）单阳管应该以样本为主，少数弱表达marker使用补偿微球进行补充。
（2）为了确保计算的补偿值正确，我们可以先圈出上一级细胞群，再从该细胞群分出阴阳群体。
（3）应用自动补偿后最好再观察每个通道荧光溢漏情况，再结合手动补偿进行微调。例如下图是在自动基础上再手动进行调整的
（4） 历史补偿值调用必须建立在电压，光学滤片，光路聚焦都没有任何改变的前提下。对于多色的样本，在调用的同时最好进行微调。
很多老师应该都遇到这样的现象，双参数荧光图在补偿调节后，大量的细胞群“下沉”至0值下方，无论怎样调动坐标也无法将这部分细胞群显示出来。只有打开Biex后才能显示完整的细胞群这是为什么呢？
其实这与细胞群的离散度有关。“离散度”指的是阳性细胞群荧光通道内的离散情况。一般阳性信号越强，细胞群实际的离散度越大。因此调动补偿后感觉细胞的离散度变大是因为一般的荧光信号都是对数形式显示，而补偿的调整是线性的过程。将对数显示的信号进行线性补偿调整后，视觉上会觉得整个细胞群被拉伸，阳性群的面积增大。离散度与使用样本类型，仪器状态，电压值都相关。
那在实验中应该怎么避免造成这种误差呢？
（1）尽量选择不同激光器激发的荧光素，可以最大限度的避免补偿。
（2）同一激光器下尽量避开选择光谱严重的重叠的荧光素，比如BV605和bv650，APC 和AF700。
（3）补偿值理论上不会高于100%，如果超过可查看某些复合染料是否在染色过程中发生了部分断裂，并确认通道的电压是否在合适的范围。
（4）补偿值如果出现负值且低于-1时，有可能是某些通道“过补偿”造成的。
正确设置单染管并精准分析，我们的实验结果才会惊艳，本期的罗工秘笈到这里也告一段落了，如果大家有其他的心得体会，也欢迎各位老师在留言区进行分享哦~
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