补偿难于上青天？！——如何使用flowjo调节补偿

上一期我们讲了流式荧光补偿这个概念，以及我们怎么使用flowjo完成流式的荧光补偿调节，这一期我们深入给大家分享纯经验内容，即：我们如何判断自己的实验结果中荧光补偿的调整是否合适。

要做到补偿调节合适，我们需要做到2点即可，第一就是该调的补偿调好了，第二就是没有补偿被调过了。

我们如何发现该调的补偿没调好呢？

关键词就是“形状”，不知道大家注意了这个问题没有，一张流式双参数散点图，在实验结果良好的情况下，形状一定是横纵走向的，即如下：

所有的双参数散点图都是呈现横/纵的走向，总的来说大部分细胞群都是圆形/椭圆形。

所以当我们发现细胞群形状明显为对角线走向时，往往提示可能出现2种问题：1.死细胞过多，2.补偿调节不到位。而后者往往在一个通道的高阳性区和另一个通道低阳性区出现对角线方向的细胞群：

例如此数据中APC-CY7/PE-CY7的双参数散点图下出现了APC-CY7 high/pecy7low的细胞群呈现了一个对角线的偏移，即提示存在补偿调节不足的情况出现。

此时我们进行反向补偿调节，即在flowjo上打开补偿矩阵，点击edit进入手动调节模式，增加pe-cy7-apc-cy7的值，即可让实验结果修复正常：

 注意，A-B即在补偿矩阵的纵列选择A通道，横列选择B通道，大家不要弄反了哦！

复后的实验结果，所有分群呈现横纵分布

针对补偿不足总结来说，我们在reviews数据时一定要去观察结果的所有双参数散点图，一旦出现流式分群的形状异常时，就应该进一步判断是否补偿不足或是死细胞干扰了。

那么，如果补偿调节过度了，我们如何发现并调节呢？

发现补偿调节过度，关键词就是“双阴性群”。如果我们在review流式结果时发现有的双参数散点图出现了比较诡异的2团阴性细胞群，就需要警惕是否是某个通道的补偿调节过度了。

比如我们在review结果时，发现BV421/fitc双参数散点图中，有2个阴性细胞群，主要是在FITC上出现了双阴性，这是就要高度怀疑fitc和某个通道的补偿调过了。

此时我们就要检测该双阴通道和其他通道的所有散点图了经过检查我们发现问题出在FITC/APC-CY7这张图上：

进一步调出这张图发现补偿出现了非横纵走向而是反向对角线走向，这就是明显的补偿过度了：

此时我们也选择在flowjo里打开补偿矩阵，减少FITC-APC/CY7的补偿值，让实验结果恢复正常：

双阴性细胞群也就随之消失了。

针对补偿过度总结来说，我们在reviews数据时一定要去观察结果“双阴性”群，出现双阴性群往往不是真的有2个阴性群，而是我们的某些通道出现了补偿过度。

解决了补偿不足和补偿过度，我们的实验结果就会更加准确了，如果大家有什么补偿的小技巧，也欢迎留言分享哦~