免疫共沉淀经验总结分享

免疫共沉淀：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整的细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间结合的保持下来。

免疫共沉淀主要是用来研究蛋白质与蛋白质相互作用的一种技术，其基本原理是，在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体，孵育后再加入与抗体特异结合的结合于Pansobin珠上的金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)，若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可以形成这样一种复合物：“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—SPA\|Pansobin”，因为SPA\|Pansobin比较大，这样复合物在离心时就被分离出来。经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，复合物四组分又被分开。然后经Western blotting法，用抗体检测目的蛋白是什么，是否为预测蛋白。这种方法得到的目的蛋白是在细胞内天然与兴趣蛋白结合的，符合体内实际情况，得到的蛋白可信度高。

1. 1.做免疫共沉淀之前，做好那些预测工作？

免疫共沉淀有两个缺陷：一是目的蛋白和兴趣蛋白的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；二是必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。

2.在加抗体之前，在cell lysate中加了protein A/G珠子进行pre-clear,然后才进行共沉淀。但是跑SDS发现，pre-clear珠子出来的条带竟然和免疫共沉淀下来的蛋白条带几乎一样（除了抗体），疑问：怎么没有加抗体也出现这么多非特异性条带？

有带是可能的，毕竟细胞内成份是很复杂的。你在做完pre-clear后，进行IP看阳性与阴性结果是否有差别，这样由于抗体和特异性结合可以排除非特异性干扰。

3.裂解液中含有1%的SDS，会影响核蛋白抽提物中蛋白质-蛋白质相互作用吗？

建议做免疫共沉淀的亲，在蛋白提取的裂解液中就不要用阴离子界面活性剂SDS,而应该用非离子界面活性剂Triton X-100。SDS属于离子变性剂，理论上是可能对蛋白的相互作用产生影响的。

4.免疫共沉淀后蛋白质的洗脱方法?

免疫共沉淀以后,蛋白质抗体复合物结合在磁珠上,离心收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，用PBS或RIPA buffer洗3遍后，蛋白电泳上样前，将上样样品煮5min，以游离抗原，抗体，珠子，离心，将上清电泳，收集剩余琼脂糖珠，上清也可以暂时冻-20℃，留待以后电泳，电泳前应再次煮5min变性。

5.IP下来的抗原量少怎么办？

鉴定抗原过程中，用IP-Western能够检测到抗原，但是用考马斯亮兰染膜却看不到蛋白条带，原因可能是因为IP下来的抗原量少。可以考虑富集原总蛋白浓度，提高IP下来的抗原量。

文章转自英格恩生物技术博客！