如何判断细胞是否被污染？

发生污染，既耽误时间又是一个灾难，熟练的无菌操作能避免许多问题，但早期检测污染是一种可以预警的方法。对于培养箱中的每瓶细胞都要注意观察，要养成习惯，每次打开培养箱时，迅速看看有没有发生污染。

细菌、酵母、真菌、霉菌、支原体以及其他的培养细胞都可能引起污染。

怎样识别污染

一、肉眼观察，把培养瓶或培养皿拿起来，对着光线检查。

• 浑浊情况。即使细胞密度很高，培养基也应该是透明的。轻轻移动或晃动培养瓶，观察培养基的浑浊或悬浮情况，一些霉菌可能会在培养基的表面形成菌落。

• 培养基颜色的变化。酸性条件下，加了酚红的培养基会由红变黄，而碱性条件下会变成红紫色。细菌污染常常会使培养基变成黄色，真菌污染会使培养基变成深紫红色。

• 闻！当然不能打开瓶子去闻，把鼻子贴在瓶口闻，许多污染发生以后都会散发出易察觉的、特殊的气味，甚至一打开培养箱门就闻到了。

二、显微观察。在倒置显微镜下，先用低倍(10 X) 再用高倍(40 X) 物镜（总放大倍数为400) 观察细胞培养皿或培养瓶中的细胞：

• 其他有机体。在低倍镜下，真菌的菌丝体成长棒状，并横穿整个视野，还可以观察到酵母，有时呈小圆球形，有时还有芽。

在高倍镜下可以观察到细菌，它们可能是棒状或球状，单独成链或成团存在，它们也可能和细胞混在一起，并且明显处于细胞内部，有些细胞可能已经裂解变得模糊。观察时可能每两个视野才出现一个污染（当然也算被污染了！），而且可能污染物是可以运动的。

• 损伤细胞。感染会杀死细胞，可能导致每个细胞都裂解和／或细胞层从附着物上完全剥离，更可能的是细胞变得不规则（或大或小），在低倍镜下是黑色的粒状

悬浮培养细胞比贴壁培养细胞更加难以显微观察，尤其是高倍显微镜下。

• 将培养瓶或培养皿放在显微镜的载物台上，静置一会。

• 将焦距对准器皿的底部，观察那些轻微附着的细胞，因为它们可能已经接触到了微生物。

• 对准整个培养瓶焦距，当发现细胞的时候，用细聚焦调节旋钮调节，仔细检查周围的培养基有没有污染发生。

图一 倒置显微镜放大倍数400 倍下观察到的贴壁细胞被污染的情况
a 霉菌； b 酵母； c 细菌，小的棒状； d 细菌，成团的球状，有些细菌已经进入细胞内部。

如果你不能确定是否发生了污染

• 制作湿涂片或染色片。取1 ml 培养基离心，用50 μl 培养基或缓冲液重新悬浮细胞，滴一滴到载玻片，盖上盖玻片制成湿涂片；或涂片、固定并染色（甲基兰或革兰氏染液），在高倍镜下观察。

• 将细胞在营养培养基或琼脂培养基上划线， 37℃培养3 天。如果有菌落，那么细胞被污染了。

• 取1 ml 的细胞培养液至无菌的微量离心管中， 37℃培养3 天。观察到浑浊物，做湿涂片显微镜观察。