之前笔者和大家讨论了高通量测序的三种主要建库方法：
16S宏基因组测序所采用的就是扩增法建库，即利用PCR方法扩增特定的分子片段，并在扩增过程中引入接头和测序引物区域的建库方法（详见前贴漫谈16S的前世今生）。
针对16S的宏基因组建库，目前市面上主要分两种类型（一步法建库和两步法建库）。
一步法建库是指通过一轮PCR反应，同时进行16S扩增和接头连接的工作，如下图a所示。
两步法建库是指通过两轮PCR反应，分别进行16S扩增以及接头连接的工作，如下图b所示。
由于一步法建库会造成某些菌的假阴性结果，定量结果也与实际结果相差较远。之前的研究表明，两步法建库的结果准确性明显优于一步法建库。目前大多数实验室采取的都是两步法建库。（详情可参见前贴【好文共赏】一管窥豹，SOP标准化在宏基因组研究中的重要性）
因此，我们今天就详细讨论下针对16S的两步法建库的流程和文库结构。
先说一下最后咱们拿到的成功的16S文库结构应该是怎么样的呢？
是这样滴~
P7锚定序列/P5锚定序列:是指文库序列和测序芯片锚定结合的片段。
Index序列：是指用于区分不同样本的序列，也成为Barcode序列。
测序引物：测序反应时所需的序列。
目标区域扩增引物序列：是指16S扩增引物序列。
看起来还是很复杂？那把两步法再拆分来看看吧。
建库第一步：
16S选择性区域扩增
此步PCR反应原理上如图所示：
蓝色为测序引物区域，绿色为扩增引物序列（可根据扩增区域的变化而变化）。
建库第二步：
第二轮扩增
此步PCR反应原理上如图所示：
紫色为锚定序列，蓝色为测序引物区域。
红色为index序列，或称为barcode。不同样本所用的index序列不同。
illumina推荐index列表如下：
如为96个样本，则illumina推荐的index安排情况为：
当然，我们也可以视自己的实验情况自行设计index：）
或者我们也可以在此基础protocal上进一步修改。
总而言之，16S扩增还是能变出很多花样（坑）滴~ 欢迎留言与大家分享
再PS：您在NGS实验中遇到过什么问题，又是怎么解决的呢？也欢迎留言与大家分享~
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