测序质控是我们拿到测序数据后第一时间要做的事情。
高质量的测序数据对我们后续工作的质量提供了保证。
fastqc提供可视化的质控报告，通过三种颜色来标注测序质量，绿色：完全正常，橙色：略有异常，红色：异常
原则上，全部为绿色的报告代表测序质量合格。然而事实上，实际产生的测序数据报告不会是全部绿色的，那么报告为什么会异常？何种异常我们需要重新测序，何种异常我们可以忽略不计呢？
在本文中，我们将质控报告分段式依次进行解说，并标记关注程度，以及出现异常后的处理方法。
1)Per base sequence quality (很重要，重点关注！)
横轴为read位置，纵轴是质量值quality，质量值越高，代表质量越好
碱基质量很好 (绿色)、碱基质量一般(黄色) 以及碱基质量差 (红色)。
像这样的图，基本都在绿色区域，代表测序质量很好
像下面这样的图，很快就进入红色区域，代表测序质量不好。建议重新测序，或者将低质量序列切除后再继续后续分析。
2) Per Tile sequence quality (不重要，可略过)
一般是这样蓝汪汪的一片，代表比较好。
3）Per sequence quality score （一般重要）
横轴为测序质量值，纵轴为 reads 数量；峰值越靠右，代表越好；如出现双峰，或者峰值比较靠左，代表有异常，即测序中存在一定比例的低质量位点。
4）Per Base Sequence Content （不重要，可略过）
这步是fastqc报告中经常黄色甚至红色报错的部分，但实际报警不一定代表质量不合格，需要分别对待。
这部分示意图横坐标是指碱基位置，纵坐标是该位置上ATCG碱基的比例。理论上，一个完美的文库，其ATCG是应该随机存在的，即图中的四条颜色的线应为互相接近的四条平行线。然而实际上的质控结果经常如上图所示，存在ATCG的波动。
如整条片段存在波动，这种情况一般出现在扩增子测序中，属于正常情况（虽然报告中标黄或红色），这是因为扩增的片段，如16S本身就具有一定的GC特点，并非完全随机。
如开头片段出现波动，这种情况一般出现在基于转座酶或内切酶的建库方法的测序数据中。这是因为酶的识别区域存在一定的偏好性，所以开头10bp左右并非ATCG随机出现。这种情况属于正常，即使是有黄色或红色报错也一般无需额外处理。
如结尾片段出现波动，可能是接头没有去除干净，建议采用生信的方法去除这部分序列。
5）Per Sequence GC Content （很重要）
这一步虽然统计的只是每条序列的GC含量的分布，但我们可以用它来评估样本中的污染情况。
对于一个正常的菌基因组文库，其GC含量分布应该接近正态分布，在图中应该是个单峰。但在实际的测序过程中，常常会发现双峰的情况，则说明文库有污染（有杂菌，或者核酸污染，或者文库污染）。
因此，如此部分报错，需要高度警惕，回查可能的原因。如为污染，需重新提取核酸后建库测序。
6）Perbase N Content（不重要）
每个位置上N的比例。
不重要。一般不会报错，或报错影响不大。
7）Sequence Length Distribution （不重要）
read长度分布。对于下机原始数据就应该是上机时设置的read 长度。此部分一般不会报错，或报错影响不大。
8）Sequence Duplication Level （一般重要）
测序read中重复序列出现的情况。
理论上，一个完美的文库应该都是unique read或duplicate很少。但，实际上考虑到二代建库过程中PCR步骤的存在，文库中存在duplication 序列无法避免。且这部分数据可后续通过生信的方法很容易去除。
因此，即使报错，对结果影响不大。
因此此部分评估结果，可以作为对文库质量控制的指标，但不用过于纠结要求必须通过。
9）Overrepresented sequences（一般重要）
显示超过0.1% 总read数的序列。对于基因组测序和宏基因组测序，正常文库内都不应该有一条序列这么高的丰度，如出现则说明可能有异常。
对于扩增子测序，出现结果则属于正常。
10）Adaptor content（一般重要）
接头含量。正常的测序结果接头应该都被自动去除了，如此步还存在一定的接头序列，则说明未去除干净，可采用生物信息方法重新去除。
简单的小结一下，虽然fastqc报告很长，对多个环节开展了质控，但其实我们并不需要追求完美，只要重点关注
Basic Statistics （基本信息统计）、Per base sequence quality（碱基质控图）、Sequence GC Content（GC分布图，用于评估污染）这三个部分。
此外，再一般关注下Sequence Duplication Level、Overrepresented sequences等4个部分就足够了。
其余的几个环节，如有报错，具体情况具体分析，但个人认为就无需强求必须全部通过了呢。
以上是笔者对于细菌基因组测序、宏基因组测序数据结果质量控制报告解读的解读。您怎么看？欢迎讨论点评～
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