1. 样品制备
① 裂解:
◆ 细胞:弃培养上清,无菌 PBS 清洗 1-2 遍(去除细胞和培养皿表面残留的培养基,因为培养基中血清含有丰富蛋白质),加入细胞裂解液(80-100ul/60mm dish) 和蛋白酶抑制剂,置摇床上摇动裂解,注意随时观察。最好冰上裂解(摇床上放冰盒,培养皿放在冰盒中)。
◆ 组织:将组织块切割成合适大小,无菌 PBS 漂洗 1-2 遍,加入细胞裂解液和蛋白酶抑制剂,高速匀浆机匀浆(低温匀浆:装有组织块的 2ml 平底 EP 管外面套一个装满碎冰的小烧杯)或高通量组织破碎仪破碎(提前预冷裂解液,把破碎过程分成几段,缩短每一小段的破碎时间,破碎的间隙把装有组织的 EP 管埋在碎冰里降温几分钟,再接着下一小段的破碎过程)。最好低温裂解。
② 去除碎片(充分裂解细胞或组织后,会有一些细胞碎片没办法完全溶解在裂解液中,需要去除):4℃下 12000rpm 离心 10-20min,取上清。(离心后细胞碎片沉在管底,上清中是抽提出的蛋白)
③ 蛋白定量:BCA 法测定蛋白浓度后分装。
④ 蛋白变性:加 loading buffer,沸水浴煮 5min。(沸水浴容易把 EP 管盖冲开,为了防止污染,也可以用金属浴或 PCR 仪来使蛋白变性。)
2. SDS-PAGE 胶制作及电泳分离
2.1 灌胶
① 洗玻璃板:玻璃板有不同规格的,能制备不同厚度的 PAGE 胶,要注意选择合适的制胶玻璃板,在制胶前,要使用洗涤剂充分洗净玻璃板和制胶梳子,去离子水冲洗数遍,把玻璃片斜靠在网篮里自然晾干,注意不要有水渍。
② 装配制胶架:玻璃板应该是配对的(一片是带玻璃直角的厚板,一片是平滑的薄板),把配对的玻璃板对好,保持两片玻璃板的底边在同一水平面,用制胶支架固定住,再安装到固定架上。注意制胶支架松紧度(紧)、制胶固定架上的夹子上的弹簧的弹性(紧)以及固定架上胶条是否干净,是否具有很好的回弹力,灌胶时要时刻注意是否漏胶,如果稍有些漏,可以在固定架上卡一个 1ml 枪头,如上图,可以人为把固定架上的夹子弄紧一点。如果漏得厉害,就没辙了,只能重新把这一套组装起来。所以最好是同时配几块,总有一块是能用的。
③ 配胶液:在 western 中用的 PAGE 胶是不连续的,分两层,上层是积层胶,下层是分离胶。配的时候先配下层的分离胶,使用 500ul 无水乙醇将胶压齐(比水压的效果好),待分离胶凝固后,倒掉无水乙醇,待乙醇挥发后,灌进去离子水清洗一下残余的乙醇,再配上层的积层胶。积层胶需要有一定高度的,一般上样孔底到分离胶之间的距离要有 1-2cm,距离太短了压得不好,太长了分离胶就短了,影响蛋白分离。
④ 插梳子:梳子有不同规格,适用于不同厚度的胶和上样体积,需要注意。积层胶液灌进去后要立即插梳子,动作要快,否则上样孔容易变形。插梳子时最好拿张厚草纸挡一挡,因为没有凝固的丙烯酰胺是有毒的,插梳子时不挡着很容易喷一脸,要注意防护。完全聚合成凝胶的聚丙烯酰胺就要安全多了。所以在丢弃剩余的胶液时,可以在等它完全凝固后再丢弃。有时候梳子拔掉了发现上样孔之间的间隔东倒西歪的,那准是插梳子时动作慢了。
⑤ 拔梳子:积层胶凝固后不要急着拔梳子,而是应该把玻璃板-胶-梳子这一套作为一个整体拆下来,装进电泳槽,倒好电泳液后再拔,电泳液里含 SDS,拔梳子时会更顺滑。
SDS-PAGE 胶配方:
△ 表中最后的 X% 是通用的计算公式,随 30%丙烯酰胺的量调整 ddH2O 的量。
△ 10% AP 和 TEMED 是催化剂,催化丙烯酰胺聚合,TEMED 可以在 4℃保存较久;10% AP 在 4℃保存不能超过一周(建议买 10g 装的小瓶 AP 粉末,P 粉末室温会吸湿,逐渐失效,因此买回后直接配制好后分装 500ul 一管,冻存在-20℃,用时取出一管溶解,一周之内用完。)
2.2 电泳分离
原理:样品在 5% 积层胶里会被压缩成一条细线,这是缓冲液中甘氨酸盐离子 Gly-和 Cl- 的作用。在积层胶里,Cl-跑在最前面,中间是蛋白样品,最后是 Gly-盐离子,Gly-和 Cl-之间形成一个电压梯度,压缩蛋白样品;到分离胶时,Gly-、Cl-跑在蛋白前面,蛋白样品脱离了电压梯度限制,开始按蛋白大小以不同速度泳动,从而按蛋白大小分离开来。
积层胶浓度:5%左右,pH 6.8。
分离胶浓度:7.5-15%,pH 8.8。不同浓度的分离胶对蛋白样品的分离能力是不同的。浓度越低,分离度越好,但小蛋白容易跑出去;常用 10-12%。
电泳注意事项:
② 在上样之前,先用胰岛素针把上样孔冲一下。
④ 往孔里加蛋白样品慢一点,且各孔的上样体积最好保持一致,没有蛋白的那个孔也用 loading buffer 给加到同样的体积,这样跑出来的蛋白条带才能比较均一,否则会出现蛋白条带往体积小或者空的孔那边飘。别忘了上一孔预染蛋白 marker。
3. 转膜
分湿转和半干转两种。
湿转:全部泡在大量转膜液里。三明治是垂直插在转膜槽里的,从负极到正极依次是:海绵垫、滤纸、胶、PVDF 膜、滤纸、海绵垫。
半干转:少量转膜液保持三明治湿润。半干转的仪器是水平的,负极在上,正极在下,没有海绵垫,滤纸直接贴电极板,从正极到负极依次是:正极金属板、滤纸、PVDF 膜、胶、滤纸、负极金属板、塑料盖。
湿转和半干转的三明治制作及转膜液配方:
转膜注意点:
④ 湿转条件一般设置在 200mA 恒流,2.5-3h,时间比较长,需要控制发热,因为发热会影响转膜效果。最好准备一个大冰盒装满碎冰,加点水,把转膜槽埋在冰水混合物里降温;还可以在转膜槽里加一颗磁力转子,把冰盒和转膜槽整个放在磁力搅拌器上,一遍搅拌一边转;或者直接把转膜槽塞到 4℃ 冰柜里降温。
⑨ 在转膜的过程中,SDS 和甲醇的作用刚好相反。
SDS 与蛋白质结合后,能使蛋白更容易从胶上转出来,但又能阻止蛋白与膜结合,尤其是蛋白与 NC 膜的结合。因此,大蛋白不容易转出,要额外加 SDS;小蛋白靠 PAGE 胶里的 SDS 就足够转出了。过多的 SDS 还会影响电流,增加发热,从而影响某些蛋白的抗原性。所以需要根据情况控制 SDS 的含量。
甲醇能破坏 SDS 与蛋白的结合,促使蛋白与膜结合,但会减小 PAGE 胶的孔径,使一些蛋白发生沉淀,从而影响实验结果,所以也得严格控制量。
4. 抗体杂交
BSA:一般是做蛋白磷酸化修饰检测时用,因为牛奶中含有丰富的磷酸 酶,会改变蛋白磷酸化修饰的状态。有时,封闭液配方和封闭条件也需要 改变,特别是大蛋白,5%脱脂牛奶封闭一小时不够;有的蛋白可能牛奶和 BSA 都不能用,可以用明胶封闭或不封闭直接上抗体。
2> 一抗孵育:使用封闭液稀释一抗,4℃过夜,或室温或 37℃ 1-X h。
1L TBS 中加入 1ml Tween 20 就是 TBST。
Tween 20:一种非离子型去污剂,有复性抗原的作用,可以提高抗体特异性识别能力;提高封闭效果,用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点,可以降低抗体的非特异性结合;乳化蛋白时不会破坏蛋白结构。
5. 图像分析
使用 Gel-Pro Analyzer 或 ImageJ(推荐);
1) 非特异条带:
抗体稀释液采用相同的封闭液;
在免疫检测过程中不要使用 SDS;
抗体质量:尝试使用不同的抗体;
2) 条带弱或无条带:
测试不同一抗和/或一抗-二抗组合;
检查样品的完整性,确保蛋白未降解;
优化封闭液浓度,建议使用浓度为 3–5% 的 BSA 或脱脂奶粉;
叠氮化物是 HRP 的抑制剂,不要在二抗缓冲液中使用叠氮化物;
转膜电场过弱,增加转膜电压或电流;
化学发光底物过灵敏,更换使用灵敏度较低的化学发光底物;
使用质量可靠的转膜仪;
6) 背景过强:
缓冲液重复利用导致污染:使用新制缓冲液;
7) 背景有污迹:
确保电泳设备、转移设备和孵育盘清洁,远离外部污染源;
8) 背景有斑点:
使用 0.2 μm 的过滤器过滤缓冲液;
9) 不同样品间内参蛋白含量不一致:
用染料给膜上的总蛋白染色,并以膜上检测到的总蛋白为内参;
10) 内参蛋白检测信号饱和:
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