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细胞流式图,你都看懂了吗?
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2022.06.24 贵州

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流式图最常用的是:直方图、散点图、等高线图。
流式通道
流式通道分散射光通道和荧光通道:散射光通道有两个,FSC和SSC通道;
FSC(Forward scatter),即前向角散射,它的值代表细胞的大小。细胞越大,背景墙上留下的阴影就越大。
SSC(side scatter, SSC),即侧向角散射,它的值代表细胞的颗粒度(granularity)。反应细胞内部细胞器或者颗粒性物质分布规则,细胞表面突起。
一般在硏究细胞样品时首先关注FSC-SSC散点图(不需要标记任何荧光素偶联抗体),x轴代表FSC值,y轴代表SSC值,分别代表细胞的大小和颗粒度这两个基本的物理特征,所以样品的FSC-SSC散点图又称为样品细胞的 “物理图”。
荧光通道表示的不是细胞特有的物理特征,而是其化学特征。
如需检测样品中是否有细胞表达某分子,则需标记荧光素偶联的该分子抗体,荧光素被相应的激光激发后产生荧光,该荧光信号通过光路系统被相应的荧光通道接收。
荧光通道值反映接收到的荧光信号的强弱,从而反映细胞上结合的荧光素的量,进一步反映细胞上表达该分子的数量,最后间接反映细胞表达某分子这一化学特征。
不同细胞群的FSC值和SSC值最多相差几倍,而荧光信号强弱之间一般相差很大,阴性细胞与阳性细胞之间、强阳性与弱阳性之间有时可以相差几十倍、几百倍,甚至几千倍,呈指数关系。所以,流式图数轴上FSC值和SSC值以“一般数序形式”表示,而荧光通道值常以“对数形式”(logarithmic scale)表示,在识图时需要注意数轴的表示形式。当然,并不是所有的荧光通道值都以“对数形式”表示,当荧光信号值相差不多时,也可以“一般数序形式”表示,如P染色检测细胞内DNA含量以及Hoechst33342染色分析和分选侧群干细胞时,均以“一般数序形式”表示。
1. 直方图(一个通道的信息)
流式直方图形成的原理与统计学中的直方图相似,是在统计学直方图的基础上进一步发展而成的。流式直方图的x轴表示一个通道的值,y轴表示细胞数量。
流式直方图虽不是如此简单,但是基本原理是相同的。流式直方图是在此统计直方图的基础上,使统计区间不断地缩小,缩小到甚至可以认为一个值就是一个统计区间,使统计的细胞数量不断地增加,增加到以万计,甚至以十万计时,相邻的小统计区间内的细胞数相差不多,这时的直方图好像是由光滑的曲线所围成的。
2. 流式散点图(同时显示2个通道的信息)
x轴表示一个通道的值,y轴表示另一个通道的值,图中每一点代表一个细胞。
与流式直方图相比,流式散点图能够同时表示两个通道的值,能够更加直观地表示细胞的信息,所以流式散点图更加直观和常用。更易于细胞分群、分类,以及确定比例关系等。
正常人外周血白细胞FSC-SSC散点图,中性粒细胞又大又复杂。
一般在流式分析过程中,先利用FSC-SC物理图根据细胞的大小和顆粒度将细胞进行分群,然后根据目标细胞处于哪个群体,再将该群体细胞设门(set gate),进一步分析该群体中的目标细胞。
门(gate)是流式分析过程中一个较为重要的概念,流式分析时有时不希望所有的样品细胞都显示于流式图中,而是希望只显示感兴趣的细胞,排除其他非相关细胞的干扰,使显示的信息更加直观,更具有针对性。
流式细胞术散点图参数FSC-A与FSC-H中的A是area的缩写,H是height的缩写。这是机器在记录信号时所采用的参数(不显示在用户界面,在调试机器的时候可以显示)。每个细胞通过激光的时候,机器都会记录一个波状信号(一个拱形的信号),H就是这个拱的高度(代表的是信号的强度),A就是这个拱的曲线下面积,代表信号强度和细胞大小的关系。其实还应该有一个参数W,是width的缩写,是这个拱的宽度,代表细胞通过激光束所花的时间。
散点图通常用于显示和比较数值。例如科学数据、统计数据和工程数据。当要在不考虑时间的情况下比较大量数据点时,请使用散点图。散点图中包含的数据越多,比较的效果就越好。气泡图要求每个数据点具有两个值(探顶值和探底值)。对于处理值的分布和数据点的分簇,散点图都很理想。如果数据集中包含非常多的点(例如,几千个点),那么散点图便是最佳图表类型。在点状图中显示多个序列看上去非常混乱,这种情况下,应避免使用点状图,而应考虑使用折线图。
3. 流式等高线图(同时显示2个通道的信息)
流式等高线图与流式散点图相似,一张流式等高线图也能同时显示两个通道的信息,所不同的是,它借助地理等高线图的形式。地理等高线图用封闭的环线代表海拔高度相同的地方,环线聚集越多,表示海拔高度变化越快,环线的中央区域表示海拔最高或者最低的区域。
流式等高线图借助地理等高线图表示细胞的密集程度,流式等高线图的环线代表的是细胞密度相同的区域,所以,环线聚集越多的地方表示此区域细胞密度变化越快,细胞最稀疏的地方还是用散点表示,环线的中央区域代表细胞聚集的中心。
流式等高线图的意义和实际应用与流式散点图较为相似,可以看作是流式散点图的一个变体。相比之下,流式散点图更为直观,所以应用也更为广泛。
当然,流式等高线图也有其自身的优点,它较能直观地体现细胞群的集中点,等密度环线的中央区域代表一个细胞群的集中点,一般代表一个细胞群,所以在某些情况下,流式等高线图比流式散点图更能直观地体现细胞的分群。
下图显示的是正常C57小鼠脾脏淋巴细胞分群的流式等高线图。
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