景杰生物 | 报道
蛋白质磷酸化修饰 (phosphorylation) 是最常见和功能最重要的一种翻译后修饰，发生在细胞内超过30%的蛋白质上。磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸 (tyrosine, Tyr) 上面，其中丝氨酸/苏氨酸磷酸化最常见。尽管酪氨酸磷酸化修饰只占到所有蛋白磷酸化修饰的2.5%，但在细胞的几乎所有生理进程中都有关键调控功能。已有研究表明，酪氨酸磷酸化水平的失调会导致多种疾病的发生，尤其是肿瘤和代谢疾病等。
在这里编者总结了近几年来，酪氨酸磷酸化修饰在多个领域中的高水平成果，以飨读者。
肿瘤发展：Cell | 肺癌EGFR突变导致酪氨酸磷酸化信号重塑
肿瘤免疫：NCB | SMAD4酪氨酸磷酸化“剥夺”TGF-β的肿瘤抑制功能
代谢调控：MSB | 高脂饮食导致酪氨酸磷酸化信号转导网络变化
病原免疫：Cell Host & Microbe | 酪氨酸磷酸化修饰调控抗病毒天然免疫
神经疾病：Cell Rep | GluN2B的酪氨酸磷酸化调控抑郁症发生
植物生物学：Nat Comm | 酪氨酸磷酸化调控赤霉素信号转导的新机制
Cell
酪氨酸磷酸化组学揭示肺癌EGFR突变引发激酶网络信号重塑的分子机制
已有大量研究表明，在肺腺癌 (Lung adenocarcinoma) 中表皮生长因子受体 (EGFR) 的致癌突变 (oncogenic driver mutations) 非常频繁。虽然酪氨酸激酶在肿瘤发生发展过程的重要性已经被熟知，但致癌突变引起的酪氨酸磷酸化信号重塑导致肿瘤发生的机制还未阐明。2019年10月3日，丹麦哥本哈根大学科研团队在Cell 上发表了题为Oncogenic Mutations Rewire Signaling Pathways by Switching Protein Recruitment to Phosphotyrosine Sites 的研究论文，运用基于质谱的酪氨酸磷酸化修饰组学技术，在肺组织中成功鉴定出由EGF介导的超过1000个酪氨酸磷酸化位点，并揭示了EGFR致癌突变导致下游磷酸化信号重塑的具体分子机制。
为了鉴定体内酪氨酸磷酸化信号是如何逐级传导的，作者分别向实验组和对照组大鼠的静脉注射EGF和生理盐水各处理5min，然后将大鼠的肺组织取出 (样品策略) 进行后续的蛋白组、苏氨酸/丝氨酸磷酸化修饰组学 (基于TiO2富集)、酪氨酸磷酸化修饰组学 (基于抗体富集)。研究共鉴定到超过45000条肽段，其中包括超过13000条苏氨酸/丝氨酸磷酸化肽段以及超过1000条酪氨酸磷酸化肽段。进一步地，为了探究酪氨酸磷酸化如何介导下游蛋白复合体的形成，作者用之前鉴定到的88个酪氨酸磷酸化位点为中心取前后各6个氨基酸合成88条带生物素标记的“诱饵”肽段，在组织裂解液中“俘获”对应的激酶蛋白，并进行蛋白组学分析。
最终，作者获取到了目前最全的EGF调控的酪氨酸磷酸化特异的蛋白互作数据库，鉴定到11个关键蛋白复合体，共74个蛋白参与EFG信号网络的传导，并描绘出了这74个蛋白之间的互作网络。在肺癌里EGFR P1091L被报道是一个高频突变，作者用A549细胞对P1091L突变的生物学功能进行了验证，发现P1091L突变体的ERK和AKT信号持续激活，并且具有更强的侵袭能力。此外，作者还验证了其他五个肺癌中常见的EGFR突变：P1019S、N1094Y、N1112S、N1140S以及P1170S。最后这些结果都证明酪氨酸磷酸化位点附近的突变可以作为分子开关调控下游复合体的招募。
图1 本研究的总结模式图
综上，研究人员借助蛋白组学的分析手段描绘出当前最全面的组织特异性的EGFR酪氨酸磷酸化信号调控网络，并且在此基础上揭示了肺癌中EGFR突变致癌的分子机制，这对于今后的临床治疗具有很强的指导意义。
Nature Cell Biology
SMAD4酪氨酸磷酸化“剥夺”TGF-β的肿瘤抑制功能
尽管TGF-β在肿瘤发生的早期具有重要抑癌作用，但肿瘤细胞自身常会建立起逃逸TGF-β信号的分子机制。例如，介导TGF-β信号的关键蛋白SMAD4在胰腺癌和消化道肿瘤中发生高频率的缺失和突变。然而，在许多其它类型的癌症中却极少出现SMAD4基因的变异，这表明非肠胃道癌症细胞中可能存在其它导致TGF-β信号失活的调控机制。2019年1月21日，浙江大学冯新华教授课题组在国际著名期刊Nature Cell Biology (IF=28.21)在线发表了题为“ALK Phosphorylates SMAD4 on Tyrosine to Disable TGF-β Tumor Suppressor Functions” 的研究论文，揭示了SMAD4在肿瘤发生过程中被致癌酪氨酸激酶磷酸化而失活的分子机制，并为ALK阳性癌症的靶向治疗提供了方向。
该研究发现，在间变性淋巴瘤激酶(ALK)阳性的肿瘤细胞中，激活型ALK能直接结合SMAD4并对其第95位酪氨酸 (Tyr95) 进行磷酸化修饰。由于Tyr95位点位于SMAD4的DNA结合结构域，该位点的磷酸化修饰导致SMAD4丧失了与DNA结合的能力。进一步研究表明，磷酸化的SMAD4不能正常传递TGF-β信号和调控下游基因的表达，导致TGF-β的肿瘤抑制功能丧失。这是在TGF-β研究领域首次发现SMAD家族蛋白存在酪氨酸位点的磷酸化修饰，鉴于大多数肿瘤细胞具有不同酪氨酸激酶的持续性激活，该研究为TGF-β信号的调控提出了新思路。另外，该项研究也提示了ALK抑制剂的潜在副作用，为ALK阳性肿瘤的靶向治疗中ALK和TGF-β抑制剂联合用药的可行性提供了理论依据。
图2 ALK阳性肿瘤中SMAD4酪氨酸磷酸化对TGF-β信号转导的影响的工作模型
Molecular System Biology
高脂饮食导致的酪氨酸磷酸化信号转导网络变化
众所周知，肥胖相关的2型糖尿病及其伴随疾病已发展成为人类主要的健康风险，但脂质过载和脂质代谢物如何导致代谢过程失调的复杂分子机制尚不完全清楚。2019年8月1日，霍华德·休斯医学研究所与麻省理工学院研究团队合作在著名学术期刊Molecular System Biology(IF=13.07) 上发表了题为“High-fat diet in a mouse insulin-resistant model induces widespread rewiring of the phosphotyrosine signaling network” 的研究论文。作者利用磷酸化修饰蛋白质组学技术评估了在响应用饱和或不饱和游离脂肪酸处理的细胞或小鼠消耗高脂肪饮食后，肝脏蛋白酪氨酸磷酸化修饰的改变情况。
作者运用基于质谱技术的磷酸化修饰组学，发现脂质和脂肪酸过载可导致体外和体内的酪氨酸信号转导网络的大量改变。这些影响同时发生在胰岛素抵抗的发展上，并且可以推测肝脏中信号转导途径的改变是肝功能障碍的重要驱动因素，这也与先前对酪氨酸磷酸酶的研究以及SFK在脂肪酸代谢和胰岛素生物学中的作用一致。
同时，作者的研究还能够证明靶向增加SFK活性或降低ROS水平及其对PTP的失活作用，会对饮食重连的信号传导网络和表型输出具有显著影响。总而言之，该项成果扩展了人们对饮食诱导的糖尿病或潜在的其他胰岛素抵抗相关疾病发病分子机制的认知，并为寻找新的治疗方法提供了可能。
Cell Host & Microbe
蛋白酪氨酸磷酸化修饰调控抗病毒天然免疫中的功能与机制
在传统意义的认知中，大家普遍认为抗病毒天然免疫通路的激活主要是由蛋白泛素化和蛋白丝苏氨酸磷酸化所介导，但对蛋白酪氨酸磷酸化修饰在抗病毒天然免疫中发挥的作用与生理功能尚不清楚。尽管此前的研究发现Src家族酪氨酸激酶 (SFK，Src family tyrosine kinases) 家族成员 (例如Hck和Fgr) 的缺失所产生的表型与宿主抵抗病原菌的侵染有关，但是其具体的分子机制尚未阐明。
2017年6月14日，浙江大学徐平龙教授课题组在Cell Host & Microbe (IF=31.32)杂志上发表了题为“Lck/Hck/Fgr-mediated tyrosine phosphorylation negatively regulates TBK1 to restrain innate antiviral responses” 的研究论文，该研究鉴定了抗病毒应答关键激酶TBK1的酪氨酸磷酸化修饰位点以及酪氨酸激酶Lck/Hck/Fgr，揭示了酪氨酸磷酸化修饰和酪氨酸激酶在抗病毒天然免疫中的关键调控作用和生理功能，并深入解析了其抑制抗病毒应答和负反馈调控的分子机制。
在病毒感染多种器官来源细胞的过程中，作者都观察到细胞内源TBK1有动态的酪氨酸磷酸化修饰，并与TBK1激活与抑制紧密相关。随后通过小分子抑制剂处理、蛋白激酶文库筛选、基因过表达和CRISPR介导的基因敲除等实验进行研究分析，证明Src家族酪氨酸激酶 (SFKs) Lck、Hck、Fgr是导致静态和病毒感染过程中TBK1酪氨酸磷酸化修饰和功能抑制的主要激酶。
从分子机制上讲，Lck/Hck/Fgr与TBK1/IKKe相互作用并形成内源复合体，直接酪氨酸磷酸化修饰TBK1的Tyr394和Tyr354，破坏其形成TBK1同源二聚体或TBK1/IKKe异源二聚体，导致TBK1失活。同时Lck/Hck也强烈修饰TBK1催化中心附近的Tyr153，进一步阻抑TBK1的激活，从而负反馈调控抗病毒天然免疫。此外，该研究也首次指出了酪氨酸激酶抑制在抗病毒防治中的潜在重要价值。这些新发现为理解抗病毒免疫机制和发展抗病毒的防治手段提供了新的理论与实验依据。
图3 TBK1酪氨酸磷酸化修饰调控抗病毒天然免疫的工作模型
Cell Reports
NMDA受体亚型GluN2B的酪氨酸磷酸化修饰调控抑郁症的新机制
目前越来越多的研究表明离子型谷氨酸受体NMDA亚型GluN2B在抑郁症中扮演十分重要角色，GluN2B的选择性抑制剂能够显著缓解抑郁样行为，但其具体的作用机制还有待阐释。2021年8月24日，浙江大学杨巍团队和罗建红团队合作，在Cell Reports (IF=10.00) 期刊上发表题为“Disrupting phosphorylation of Tyr-1070 at GluN2B selectively produces resilience to depression like behaviors” 的研究论文，揭示了内侧前额叶皮层 (mPFC) NMDA受体GlN2B亚基Tyr1070的磷酸化选择性调控介导抗抑郁样行为的新机制，也为治疗抑郁症提供了新的思路。
研究团队在前期研究中已发现GluN2B亚基的Tyr1070磷酸化能通过协同调控Tyr1472磷酸化进而阻止NMDA受体细胞膜的内化，但该调控机制的生理病理功能尚不清楚。作者在本研究中发现GluN2B Y1070F的遗传突变小鼠选择性导致mPFC的GluN2B上Tyr1472磷酸化水平降低，表现出了脑区选择性的调控作用。脑片电生理结果证明突变小鼠mPFC第5层锥体神经元的突触NMDA受体功能正常，但突触外GluN2B亚型NMDA受体功能显著下调，表明Tyr1070选择性调控非突触NMDA受体的细胞膜定位。
随后，通过组合脑片电生理，生化实验和高尔基染色等方法，作者发现突变小鼠前额叶皮层的mTORC1活性显著增强，导致神经元兴奋性突触数量增加，从而产生了抗抑郁样行为。总的来说，该研究揭示了一种mPFC脑区NMDA受体酪氨酸磷酸化选择性介导抑郁症的新机制，有望实现针对NMDA受体选择性干预抑郁症而不影响其生理功能，为针对NMDA受体靶点开发治疗抑郁症药物提供新的思路。
图4 GluN2B的1070酪氨酸磷酸化选择性调控前额叶皮层锥体神经元兴奋性突触数目的工作模型
Nature Communications
酪氨酸磷酸化调控赤霉素信号转导的新机制
赤霉素 (GA) 是调控植物生长发育的重要激素。蛋白DELLA是GA信号响应的阻碍蛋白，GA的受体GID1A与DELLA形成复合体后，可通过泛素化蛋白酶体途径降解DELLA。染料木黄酮(genistein) 是一种已知的酪氨酸激酶抑制剂，可抑制DELLA降解。然而，酪氨酸磷酸化对GA响应的生物学作用尚不清楚。
2017年10月17日，日本科研团队在Nature Communications期刊上在线发表了题为“Tyrosine phosphorylation of the GARU E3 ubiquitin ligase promotes gibberellin signalling by preventing GID1 degradation” 的研究论文，揭示了E3泛素连接酶GARU的酪氨酸磷酸化可通过阻止GID1A的降解以促进赤霉素信号转导。
本研究发现拟南芥中GARU可介导泛素依赖的GID1A降解，染料木黄酮的靶标蛋白酪氨酸激酶TAGK2可通过磷酸化GARU的Tyr321以抑制GARU与GID1A的相互作用。染料木黄酮可诱导GID1A降解和DELLA积累。相反地，拟南芥GARU突变体和过表达TAGK2植株可促进GID1A稳定和DELLA降解。另外在盐胁迫下，GARU可抑制种子的萌发。总而言之，GA的信号响应由GARU依赖的GID1A泛素化负调节，由TAGK2介导的GARU的Tyr磷酸化正调节，并且染料木黄酮通过抑制TAGK2从而抑制GA信号转导。
图5 通过GARU依赖的泛素化和TAGK2依赖的酪氨酸磷酸化控制GID1A蛋白稳定性的工作模式图
后记
本文总结了酪氨酸磷酸化在多个领域的应用，主要分为动物领域和植物领域。动物领域包括癌症的发生发展机制与治疗靶点发现、脑部疾病的发生机制、病原体感染宿主后的免疫反应等；植物领域包括植物生长发育的调节机制、逆境胁迫的应对机制等。
目前景杰生物结合领先的4D蛋白质组学技术平台，推出4D-酪氨酸磷酸化修饰组学产品，可实现对组织、细胞等多种生物样本的高深度、高准确度的酪氨酸磷酸化修饰组学定性和定量分析，在多个研究领域中助力研究人员解密蛋白酪氨酸磷酸化修饰对于机体生理和病理的调控机制。景杰抗体PTMab可提供经严苛验证的酪氨酸磷酸化泛抗体: PTM-702RM Anti-Phospho-Tyrosine Rabbit mAb。
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参考文献
1. Lundby A, et al. 2019, Oncogenic Mutations Rewire Signaling Pathways by Switching Protein Recruitment to Phosphotyrosine Sites. Cell.
2. Zhang Q, et al. 2019, ALK phosphorylates SMAD4 on tyrosine to disable TGF-β tumour suppressor functions. Nat Cell Biol.
3. Dittmann A, et al. 2019, High-fat diet in a mouse insulin-resistant model induces widespread rewiring of the phosphotyrosine signaling network. Mol Syst Biol.
4. Liu S et al. 2017, Lck/Hck/Fgr-Mediated Tyrosine Phosphorylation Negatively Regulates TBK1 to Restrain Innate Antiviral Responses. Cell Host Microbe.
5. Shi X et al. 2021, Disrupting phosphorylation of Tyr-1070 at GluN2B selectively produces resilience to depression-like behaviors. Cell Rep.
6. Nemoto K et al. 2017, Tyrosine phosphorylation of the GARU E3 ubiquitin ligase promotes gibberellin signalling by preventing GID1 degradation. Nat Commun.
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