多平台比较，三代扩增子高度还原微生物群落结构

环境微生物组与生态健康和人类生活息息相关。从各种微生物中获取详实的高分辨率分子信息将有助于人们对环境微生物群落展开精确研究，实现微生态与环境和人类的平衡共赢。伴随着三代测序技术的成熟与发展，利用三代测序进行微生物群落特征性区域测序及分析已成为研究复杂微生物群落结构及功能的重要技术手段。近期，重要的环境类期刊Environmental Research （IF=6.793）报道了以三代测序技术为基础，进行高通量微生物群落模式研究的HiLi-Chip技术，其对样本的还原性、操作便易性、高通量低成本及与三代测序技术结果得一致性等方面均有良好表现。

研究采用九龙江沿岸近农村地区（H0）延伸到城市建成区（H5）的六个位点（H0-H5）取水体样本进行相关理化因子（总碳含量、总有机碳、总氮含量、无机碳含量等）及微生态群落结构的检测与分析，并分别采用基于illumina平台的二代扩增子技术（V4-V5区，引物515F-907R）、基于PacBio平台的全长扩增子技术及三种不同混合体系的HiLi-Chip方案（HiLiC_1、HiLiC_2、HiLiC_4）（引物 27F-492R）方式进行（如下图），比较了不同平台及技术间的研究效果差异。

主要结论

1、水体环境理化因子变化

上游H0位点水体具有最低的总碳、总有机碳、总无机碳和总氮含量。但其有机碳氮比最高，与下游样本相比表现出独特的水环境条件。在H2位点，水体中碳含量及碳氮比为H1位点的两倍，下游的三个位点H3、H4、H5的水体具有相似的水理化特征。

2.、不同测序方法及HiLi-Chip方案研究细菌多样性的结果比较

在相同数据量条件下，基于三代全长技术鉴定获得的微生物OTU数量显著高于二代平台研究结果（下图A，B）。基于illumina平台获得的OTU丰富度相对较低，而基于三代平台和PB测序组与HiLi-chip方案在揭示细菌多样性方面没有显著差异。此外，Pb测序方法与不同混合方式的HiLi-Chip方法研究的沿河细菌多样性趋势保持一致（下图C）：H1>H3≈H4≈H5>H0≈H2。

3、不同分类层级的细菌群落组成

在群落组成方面，OTU层级上应用的各种方法鉴定出不同位点都是彼此独立的。但不同方法在细菌分类上的结果在门、科属水平上基本一致（下图A），相比于二代测序方案，PacBio测序及HiLi-Chip方案可以鉴定出更多的物种（下图A），主要优势物种为变形杆菌、放线菌及拟杆菌物种。在门、科和属水平上，前 10 个优势类群的组成和比例也出现了类似的结果（下图B）。不同位点间群落构成变化趋势在不同技术方案中也呈现出较为一致的变化趋势：H3的类群丰度构成介于H1与H2之间，且与H4相似（下图B）。

 研究中同时检测了HiLi-Chip揭示稀有OTU的能力：HiLi-Chip方案坚定了超过71%的稀有OTUs，且不同混样方案在稀有类群研究中的结果高度一致。说明HiLi-Chip方法在揭示细菌组成、优势菌相对丰度、沿河优势菌的空间变化格局，甚至稀有物种的高度覆盖率方面获得的结果稳定可靠。

4.、潜在的人体病原菌鉴定

通过不同技术手段鉴定出的水体中潜在人类细菌病原体存在技术层面差异：基于illumina二代测序方法进检测出7个种水平的病原体，而HiLi-Chip方案检出了36个OTU注释到18个种的病原体，其中72.2%的物种至少被两种方案检测到，丰度最高的三种病原体为Aeromonas hydrophila ML09-119, Bacillus megaterium QM_B1551,

和 Bacillus cereus G9842（下图示）。三种HiLi-Chip混合方案与PacBio全长扩增子测序方案在人类潜在细菌病原体的α-多样性和相对丰度检测结果上几乎无差异，且相较于二代测序方法，病原体检测的频率和灵敏度更高。

5、核心细菌

研究中发现HiLi-Chip与PacBio全长扩增子结果一致性极好，通过HiLi-Chip方案可确定56个核心OTU占全部细菌相对丰度的27.4%，主要由7个门的物种构成（Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Cyanobacteria, Armatimonadetes, Firmicutes, Planctomycetes）。其中62.5%的核心物种为Betaproteobacteria和Alphaproteobacteria。此外，核心菌群与环境理化因子之间表现出强相关性。

6、确定性和随机过程的相对重要性

       沿河细菌的OTU发生频率之间的关系与中性模型拟合结果现实：H3位点细菌群落主要由确定性过程构建，中性模型的拟合度较低；而尽管H5位点的迁移率最低，但H5的中性群落模型R2值更好，生态位广度更广，表明随机生态过程在H5群落结构中其更重要作用。

7、共现网络

基于spearman分析沿河细菌的相互作用关系，沿主河道，细菌群落间的关系更紧密，共生网络更为复杂、节点更多，H0到H5的平均度也更高（下图A-C），与其他位点相比，H5具有最复杂的网络关系及最高比例的负相关网络。但正相关关系仍为细菌网络的主导。此外，H5的核心细菌更多，与之相比H3则更为松散，核心细菌也更少。值得注意的是，在所有网络中核心菌种和核心菌种之间主要为正相关关系；而核心菌种与其他物种之间则存在更多负相关性（下图D）。

讨论

1. HilLi-Chip方案具有如下优势

可靠、高通量，适用于大规模环境微生态结构研究，成本低也更省时，可是便稀有菌种并对人类潜在病原体识别具有更高灵敏度，具有极大的研究实用性及开发潜力。

2. 核心菌群的关键作用

可代表整个样本的微生物群落特征，并通过与其他核心物种协同作用参与网络调节。

3. 河流交汇处网络及社区集结

在竞争压力更大的情况下，河流汇合区微生态具有更多的密切互作和复杂的共现网络。H5的细菌群落比H3具有更广泛的生态位宽度，这意味着它们在资源竞争和环境适应性方面更具竞争力。此外，在有限的营养物质和类似的上游环境中，细菌往往会施加竞争压力，从而在下游河流汇合处（RC）形成一个更加紧密的网络。而狭窄的生态位分布和上游环境异质性可能促进了生态位互补和环境选择，导致河流中段RC的环节减少。核心细菌可能代表整个细菌群落，并通过与其他核心细菌的协同相互作用来增强网络稳定性。

综上，基于三代长片段测序技术的HiLi-Chip技术是快速全面分析环境样品中微生物群落的强大工具，并且对于深入了解环境微生物相互作用具有重要意义。

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参考文献：

HiLi-chip: A high-throughput library construction chip for comprehensive profiling of environmental microbial communities. Environmental Research, 2022.