snRNA、scRNA傻傻分不清的时候，人家已经开始择优了，如今的单细胞有当年高通量测序之势，势不可挡，不得不用~小编就带大家看一下这篇2023年发表于《Plant Science》的文章。
植物单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术为深入了解基因表达调控机制和物种进化提供了有效的助力。
scRNA-seq研究在植物中具有天然的局限性
● 一些成熟度高的部位，他们的细胞壁很厚、木质化程度高，难以消化；
● 某些组织细胞过大（如乳汁管laticifer cells），无法通过微流控芯片的管道，造成堵孔；
● 组织里细胞类型复杂，无法同步消化释放出来；
● 原生质体极度脆弱的，制备过程产生大量破碎细胞和碎片;
● 含有大量次生代谢物，对酶解过程，或者后续反转录和扩增过程有抑制作用。
除了scRNA-seq，单细胞核RNA测序（snRNA-seq）是原生质体获取具有难度的物种进行单细胞水平检测分析的替代选择。
snRNA-seq的优势
● 一些成熟度高的部研究对象广，如冻存样本、较难制备原生质体组织（难以酶解、细胞壁厚等）均可适用，样品保存和运输更便捷；位，他们的细胞壁很厚、木质化程度高，难以消化；
● 降低细胞类型偏好性，获取更全面的细胞类型，发现稀有细胞类型，挖掘新Marker基因；
● 避免酶消化导致应激基因表达，减少“转录偏好”；
● 核内基因更多保持了转录本的异构体和可变剪接信息，可提供更高比例的未剪接的pre-mRNA；
● 提取的细胞核，可以使用过流式分选、离心、细胞筛等手段，去除大部分碎片杂质和次生代谢产物，获得高纯度的细胞核；
●与scRNA-seq在细胞分群上趋于一致，具有类似的基因检出率。
那么，具体项目中scRNA-seq和snRNA-seq两者如何选择？
本研究使用密度梯度离心代替流式细胞术分选技术以获得拟南芥叶片细胞核。提取同等状态的拟南芥原生质体进行比较实验（图1A）。设置7个生物学重复组，使用相同的聚类参数进行数据处理，以比较snRNA-seq和scRNA-seq转录组的差异。
研究主要结果
1、测序数据质量评估
通过reads数、原始读取中的clear reads比率、reads的Q30等参数评估每个文库的测序数据质量。在细胞核和原生质体中分别获得了约2931亿和2633亿条raw reads。质控制后，clean reads占比为90.5%和86.3%。snRNA-seq获得了包含10516个细胞核的21668个基因的数据，scRNA-seq获得了9015个细胞的19955个基因的数据。
为了鉴定不同的细胞群，使用Seurat软件包对 10516 个细胞核和 9015 个细胞转录组进行聚类分析。使用UMAP绘制了snRNA-seq和scRNA-seq转录组的细胞分布情况（图1 B-C）
2、通过marker基因对基因簇进行注释
拟南芥成熟叶片的主要细胞类型都能在snRNA-seq 转录组中被鉴定（共17个簇），在scRNA-seq 转录组中注释到16个簇。snRNA-seq 数据集中有两个表皮细胞簇，但在scRNA-seq 数据集中只有一个表皮细胞簇。
3、snRNA-seq和scRNA-seq转录组的比较
为了进一步评估两种方法之间的差异，将本研究的snRNA-seq和 scRNA-seq 数据以及最近一项研究的 scRNA-seq 转录组数据进行了整合，总共产生了17 个簇，这三个数据集在UMAP图上产生了良好的分布重叠（图3）。研究进一步计算三个数据集中每种细胞占总细胞的比例，发现snRNA-seq数据集中鉴定的表皮细胞比例明显高于scRNA-seq。
研究结论
与scRNA-seq相比，snRNA-seq技术具有以下几个优势：可以减少细胞捕获过程中因细胞大小不同等因素造成的不同细胞类型比例出现偏差的问题；减少酶解过程对细胞转录的影响；可以使用冷冻样本。其局限性主要在于细胞质遗传信息的丢失。
参考文献
An optimized FACS-free single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) method for plant science research.Plant Science,2023.
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