基因编辑的原理和载体结构

基因编辑技术是指通过核酸酶对靶基因进行定点改造，实现特定DNA的定点敲除、敲入以及突变等，最终下调或上调基因的表达，以使动植物、细胞等获得新表型的一种新型技术。

目前基因编辑技术主要包括：（1）锌指核酸酶技术(ZFN)；（2）转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALEN)；（3）规律性间隔的短回文序列重复簇(CRISPR) 。‍

锌指核酸酶技术

1

1984年，科学家们在非洲爪蟾的转录因子中发现锌指蛋白，后来经过人工改造并连接上核酸内切酶后，发展为基因工程编辑工具：锌指核酸酶技术（ZFN）。

工作原理：通过多个锌指蛋白串联起来形成一个锌指蛋白组，从而识别一段特异的碱基序列，具有很强的特异性和可塑性，很适合用于设计锌指核酸酶（ZFNs）。与锌指蛋白组相连的非特异性核酸内切酶来自FokI的C端的96个氨基酸残基组成的DNA剪切域。FokI是来自海床黄杆菌的一种限制性内切酶，只在二聚体状态时才有酶切活性，每个FokI单体与一个锌指蛋白组相连构成一个ZFN，识别特定的位点，当两个识别位点相距恰当的距离时（6-8bp），两个单体ZFN相互作用产生酶切功能。从而达到DNA 定点剪切的目的。

转录激活子样效应因子核酸酶技术(TALEN)

2

2007年，德国科学家在植物黄单胞菌（Xanthomonas）中发现一种特殊的分泌蛋白质—转录激活因子样效应物（Transcription activator-Like effector, TALE）该蛋白质能够结合植物宿主基因组并激活转录。2009年，TALE结合ＤＮＡ的机制被阐明。随后在2012年，转录激活因子样效应物技术出现，并逐渐取代了锌指核酸酶技术。

作用原理：与锌指核酸酶技术相似，TLALEN也由两部分组成，一部分是 ＤＮＡ 的特异性识别和结合区域—TALE，另一部分是与ZFN相同的ⅡＳ型的 Fok1核酸酶，通过二聚体化使目的片段产生双链的断裂。再通过激活细胞内的修复机制，利用NHEJ通路修复损伤，或者引入修复的ＤＮＡ模板，通过高保真的同源重组修复，来修复ＤＮＡ的双链损伤。

CRISPR/Cas核酸酶技术

3

1987年在大肠杆菌中发现29个核苷酸长度的重复序列中间被 32个核苷酸长度的非重复序列间隔开。2002年，Jansen等将这种微生物基因组中发现的重复序列正式命名为CRISPR（Clusteren Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）。2012年Jinek等人，将分开作用的crRNA 和TracrRNA通过一段接头连接在一起，形成一条单一指导RNA（single-guide RNA, sgRNA），这种RNA仍然能高效地介导 Ｃａｓ９ 蛋白对DNA的定点切割，从而将CRISPR/Cas系统简化为Cas9/sgRNA系统。

CRISPR的结构及其工作原理：基因工程中常用的Cas核酸酶是Cas9核酸酶。它由1409个氨基酸组成，有 ２ 个重要的核酸酶结构域（RuvC 和 HNH）。其中RuvC由３个亚结构域组成，RuvCⅠ靠近Cas9序列的Ｎ端，RuvC Ⅱ／Ⅲ位于ＨＮＨ结构域靠近蛋白质的中间的位置。HNH结构域负责断裂通过互补靶向的ＤＮＡ单链，切割位点位于PAM（Protospacer-adjacent motifs）序列上游3nt处。RuvC结构域负责断裂另一条DNA链，切割位点位于PAM序列上游 ３～８nt处。 

CRISPR/Cas9结构

CRISPR

载体

4

上图为CRISPR基因编辑实验中常用的一种重组质粒载体骨架。它主要包括下边几个部分：

1. ori（Origin of Replication）

ori是origin的缩写，它是DNA序列上固定的复制起始点。ori对于宿主扩增质粒的能力至关重要，这也是为什么质粒在分子生物学实验中方便易用的重要特征。

2. U6 promoter （U6 启动子）

启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，一般位于转录起始位点上游。U6启动子，属于真核生物RNA聚合酶III，无物种特异性。

3. gRNA scaffold

gRNA scaffold sequence 是gRNA内负责Cas结合的序列，不包括用于引导Cas9靶向DNA的20bp间隔/靶向序列。

4. CaMV enhancer（CaMV 增强子)

增强子是DNA上一段能与蛋白质结合的区域。与蛋白质结合后，基因的转录作用会增强。

5. Kozak sequence

Kozak 序列通常为ACCACCAUGG，位于起始密码子AUG的两侧，通过与翻译起始因子的结合而介导5'帽子-mRNA的翻译起始。AUG后的G和-3位的A对翻译起始至关重要，-15位~0位一般不含有T碱基。在真核表达载体中插入Kozak序列的目的一般是用来增强真核基因的翻译效率。

6. 3× FLAG

三个串联的FLAG表位标签，适用于基于抗体的亲和纯化。

7. eSpCas9（1.1）

Cas9核酸内切酶，来源于化脓链球菌的II型CRISPR/Cas系统，经过突变以提高靶向特异性。

8. nucleoplasmin NLS

核浆蛋白的二分核定位信号。

9. PuroR

一种抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Gene），能够达到在含有相应抗生素的培养基中筛选出携带有该质粒的目的。本质粒中的PuroR表达的是嘌呤霉素N-乙酰转移酶。即该质粒能在含有嘌呤霉素的培养基中筛选。

10.bGH poly(A) signal（bovine growth hormone polyadenylation signal，牛生长激素聚腺苷酸化信号）

bGH是真核生物mRNA3'端的加尾信号，用于转录终止，该信号终止较弱。常用的转录终止子还包括SV40、hGH、rbGlob等，终止转录信号较强。

11. f1 ori（f1 bacteriophage origin）

f1噬菌体复制起始位点，其箭头所指方向为链合成方向。

12. AmpR promoter

氨苄抗性基因的启动子

13. AmpR

氨苄抗性基因

END