转录因子的作用
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植物在长期进化过程中，形成了多种机制和复杂的信号网络，从而迅速地感知外界环境，调控基因的表达，以适应、抵抗和耐受各种生物和非生物的胁迫。接收到外界环境信息后，植物可以在多层次上调控目的基因及其产物，作出适应性变化以响应环境，包括基因水平、转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平的调控。其中蛋白活性调控（如修饰激活/失活降解/定位改变等）往往能快速地响应外界环境变化，而转录调控往往是多方面、深层次的响应。
转录因子（Transcriptionfactor，TF)是一种能与特异DNA序列结合的蛋白，可以单独或与其他蛋白形成复合体，提高或阻断特定基因对RNA聚合酶的招募，调控基因的表达。转录因子的特点是它包含一个或多个DNA结合域（DNA-binding domain，DBDs），通过这些结合域与基因附近的DNA序列结合，从而完成调控。
转录因子的结构与功能
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2.1 DNA结合区
DNA结合区(DNA-binding domain)是指转录因子识别 DNA 顺式作用元件并与之结合的一段氨基酸序列，相同类型转录因子DNA结合区的氨基酸序列较为保守。
植物转录因子中比较典型的DNA结合区有bZIP结构域、锌指结构域、MADS结构域、MYC结构域、MYB 结构域、Homeo(HD)结构域以及 AP2/EREBP结构域等。其中一些结构域又可根据其特征区中保守氨基酸残基的数量和位置划分成几个亚类。
2.2 转录调控区
同类转录因子的主要区别在于它们的转录调控区(transcription regulation domain) 各不相同，转录调控区包括转录激活区和转录抑制区两种，它们决定转录因子功能的差异。
典型的植物转录激活区一般具有这些特征，如富含酸性氨基酸、富含脯氨酸或者谷氨酰胺等。虽然有许多实验结果显示转录因子中有转录抑制区的存在，但对其结构和作用机理了解不深，转录因子抑制区的作用方式可能有：(1) 与启动子的相关位点结合后阻止其他转录因子与该启动子结合；(2) 通过对其他转录因子的抑制作用阻止转录；(3) 通过某种方式改变DNA的高级结构使转录不能进行。
2.3 核定位信号区
核定位信号区(NLS)是转录因子中富含精氨酸和赖氨酸残基的核定位区域，转录因子进入细胞核的过程受该区段控制。不同转录因子中NLS的数目有所不同，一个转录因子可含1至数个NLS功能区，它们不规则的分布在转录因子中，有的NLS还存在于其他功能区内。
2.4 寡聚化位点
寡聚化位点(oligomerization site)是不同转录因子借以发生相互作用的功能域。它们的氨基酸序列很保守，大多与DNA结合区相连并形成一定的空间构象，如 bZIP 类转录因子的寡聚化区包括1个拉链结构，而bHLH型转录因子含有螺旋-环-螺旋结构，MADS 转录因子的寡聚化区则形成两个a-螺旋和两个β-折叠。转录因子的寡聚化能影响转录因子的活性。
转录因子与DNA结合的主要研究手段
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3.1 Y1H
Y1H是酵母双杂交的衍生技术, 用于分析转录因子与DNA之间的相互作用, 以研究真核细胞中的基因表达调控(Li and Herskowitz, 1993)。在Y1H分析系统中, 将特定顺式作用元件构建到pLacZ2μ酵母表达载体上, 将编码转录因子的cDNA构建到pB42AD酵母表达载体上。将上述2种融合表达载体共转化至酵母细胞中, 此时转录因子若能结合在顺式作用元件上, 则会启动下游报告基因的表达。目前, Y1H技术主要用于鉴定DNA结合位点, 筛选潜在的DNA结合蛋白(转录因子), 因操作简单且耗时短受到研究者的青睐。然而, 在利用Y1H分析转录因子与DNA的结合时可能受到酵母内源表达激活物的影响, 即存在假阳性问题。此外, 由于融合蛋白对酵母细胞有毒性或者在酵母系统中不能稳定表达等原因, Y1H会产生假阴性结果。在实际操作中, 可通过设置严格的对照实验减少假阳性和假阴性结果的干扰。
3.2 EMSA
EMSA是另一种研究转录因子与DNA结合的实验技术, 可用于定性和定量分析。通常将纯化的蛋白和同位素或生物素标记的DNA探针共同孵育, 然后在非变性聚丙烯凝胶上电泳, 从而将DNA-转录因子复合物与不结合的探针分离。由于分子量变大, DNA-转录因子复合物比不结合的探针迁移速度慢, 因此转录因子结合标记探针后使自由探针含量减少。研究者通常按照上述2个标准判断转录因子是否结合DNA。然而, EMSA很难鉴定低亲和力的结合元件; 也无法鉴定蛋白复合体与DNA之间的结合。此外, 作为体外检测手段, EMSA不能反映体内蛋白与DNA的结合。
3.3 瞬时表达
瞬时表达体系是检测转录因子对下游基因调控作用(促进或抑制)的技术方法。通常包括本氏烟草(Nicotiana benthamiana)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)原生质体2种操作体系。利用本氏烟草瞬时表达体系分析转录因子对基因的表达调控时, 将融合编码转录因子cDNA的双元表达载体以及融合特异基因启动子-LUC报告基因的表达载体共同转化烟草叶片。若转录因子调控该基因的表达, 那么下游报告基因LUC的表达将发生变化, 进而导致其编码的荧光素酶活性改变, 可通过体外喷施荧光素酶底物进一步检测这种变化。利用拟南芥原生质体瞬时表达体系分析转录因子对基因的表达调控时, 首先将编码转录因子的cDNA构建至pUC18-3HA载体上, 然后将特异基因启动子序列构建至pGreenII0800-LUC载体上。pGreenII0800-LUC载体含有编码萤火虫荧光素酶(LUC)以及海肾荧光素酶(REN)的基因序列。REN基因由35S启动子驱动, 其编码的REN与底物反应产生的荧光读数(LUCRenilla)作为内参。LUC基因由外源插入的基因启动子驱动, 其催化底物产生的荧光值读数为LUCFirefly。以LUCFirefly/LUCRenilla比值表示转录因子对基因的转录调控作用。目前, 瞬时表达体系由于其操作简便和表达效率高等优点备受研究者青睐。此外, 相比获得永久性的转基因材料, 瞬时表达的外源基因不会遗传给下一代, 因而生物安全性很高。
3.4 双荧光素酶实验
某些转录因子仅与其靶启动子中的特异序列结合，这些特异性的序列被称为顺式作用元件，转录因子的DNA结合域和顺式作用元件实现非共价结合，从而对基因的表达起增强或抑制的作用。双萤光素酶报告实验（dual luciferase assay）是检测转录因子和靶启动子中的特异顺序结合的重要手段，通过检测转录因子表达水平的改变对荧光素酶基因表达水平的影响，分析转录因子能否作用于启动子。
3.5 染色质免疫共沉淀
染色质免疫沉淀技术 (chromatin immunoprecipitation assay，ChIP)被广泛用于研究体内转录因子与靶基因启动子上特异性核苷酸序列的结合，并已成为研究染色质水平基因表达调控的最有效的方法。ChIP的基本原理是在活细胞状态下固定蛋白-DNA复合物，并将其随机切断为一定长度的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段。通过对目的片断的纯化与检测，从而获得蛋白质与DNA相互作用的信息。通过qPCR或二代测序，筛选与目的蛋白互作的DNA信息。ChIP-PCR用于鉴定转录因子结合到靶基因的启动子上，而ChIP-seq用于筛选转录因子直接结合的靶基因，探究转录因子的作用元件。
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