细胞作为生命活动的基本单位，也是咱们生命科学及医学领域最重要的实验材料之一。
学会正确地进行细胞培养是细胞实验的基础，养好细胞是很多实验成功的关键。
然而，做过的人都懂，这细胞培养虽是入门手艺，可一点都不简单呐！
分分钟来个污染...（细胞的污染是必然事件，而不污染是随机事件。）
然而，对于养细胞的人来说，真的是不想看到细胞的污染。
细胞的污染将直接导致实验材料的不纯净，造成数据的错误，及后续实验结果的不可靠。
因此，细胞的污染一旦出现，往往代表着实验按下暂停键，又要重复进行前面的细胞获取和培养实验，很可能几个月的埋头苦干就此白费。
为此，小编为大家整理了：细胞污染的常见原因及处理办法，希望能够帮助到大家。
细胞培养中的常见污染
细胞污染是一个很广的范围，微生物的种类更是各种各样，不同的污染的原因不同处理也不同，因此掌握对常见细胞污染的识别至关重要。
细胞培养中常见的生物污染类型有细菌污染、支原体污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及交叉污染等污染。
每一种污染都有各自的特点。如细菌和霉菌增殖迅速，短时间就对细胞造成明显伤害；而支原体和病毒对细胞的影响则是一种缓慢长期的过程。
下面就具体看看每一种污染：
（1）细菌污染
主要特征：①低倍镜下观察不到正常细胞形态，黑色沙粒状布满细胞间隙或培养基，高倍镜下可见杆状或球状的细菌在培养基中游动；②培养液一般会浑浊变黄，稍微振荡后可见培养基表面有漂浮物。
需注意的是，在污染初期，细菌常成群存在，不一定会有明显的运动，此时需引起警惕。
芽孢杆菌、葡萄球菌是细菌污染的主要菌属。
（2）真菌污染
主要特征：①一般培养液清亮，不变色；②比较容易发现，肉眼可见点状菌落（淡黄色或者白色）漂浮在培养基表面；②镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，像珊瑚状，慢慢的会长出很细的黑色丝状物；③真菌的运动能力较弱，镜下一般看不到运动。
真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
常见的真菌污染是白色念珠菌污染。
（3）支原体污染：
主要特征：①培养液一般培养液一般会浑浊；②黑色的，在镜下无法看到；③支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
支原体是一种自然界中能独立生活的最小微生物，能通过细菌滤器，在细胞培养过程中，支原体感染发生率很高。支原体是牛血清中最常见的微生物之一。
（4）黑胶虫污染：
主要特征：①低倍镜下观察时可见黑色小点，高倍镜下可看见黑色的小虫游来游去；②培养液不浑浊。
对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。
（5）病毒污染：
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。
（6）交叉污染：
由于细胞培养操作时，各细胞株所需的器具和试剂没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。
首先我们要知道，在任何情况下，完全去除细胞中的微生物污染是非常困难的！因为不管是哪一种操作，对细胞的生长而言都是一种额外刺激，很有可能导致细胞状态改变甚至死亡；而过度使用抗生素可能产生更强抗性的菌株，撤药后极易复发。
所以，对于确定污染的细胞最好的办法就是及时丢弃，积极排查细胞污染的原因。
除非是特别重要的细胞才会去抢救，而且抢救污染的细胞本来就有一定的风险，搞不好还可能会污染别的细胞。
那么如何挽救呢？我们可以尝试以下处理方法进行挽救。
（1）判断污染源。
一旦发现细胞有污染的迹象或已污染，立即判断可能的污染源：有无操作不当？培养基、胰酶、PBS等颜色、澄清度是否正常？
（2）及时处理。
若确定现有的培养基、胰酶、PBS可用，则继续使用；若无法确定则新配完全培养基、PBS、胰酶，原有的液体在确定是否污染后再做处理。
细菌和真菌的清除：
①抗生素法：抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。
污染后清除用药需采用大于常用量5-10倍的冲洗法，于加药后作用24-48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。
②裸鼠体内接种法
动物体内接种除菌法是利用动物的免疫系统来消灭污染微生物的方法。常用的动物裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠，其T细胞缺失，致使特异性细胞免疫功能丧失,但B细胞功能依然正常以及非特异性细胞免疫系统NK细胞活力强,故可用于肿瘤细胞的污染清除。
裸鼠体内接种法是比较有效和彻底的除菌方法。对于一些特别珍贵的肿瘤细胞，可采用裸鼠体内接种法。
支原体的清除
①支原体清除剂(MRA)是解决细胞培养中支原体污染严重问题的有效方法。
②清洗纯化法：其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。
③药物处理，如敏感抗生素的抑杀作用。
④使用支原体特异性血清：用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染
黑胶虫的清除：黑胶虫污染主要源于血清，故实验时尽量采用质量和口碑较好的血清培养。建议如果细胞有可能是此种污染的话，可以更换血清，增加细胞密度，提高细胞的生长率。
针对病毒和交叉污染较难清除，建议丢弃细胞重新培养
上述污染去除方案均是在细胞极其珍贵情况下的无奈之举，在细胞易于获得的情况下还是建议大伙儿直接处理掉污染的细胞，重新以新批次细胞进行试验，不仅节约时间，而且风险更小。
微生物污染在细胞培养中是非常常见的，也是令人头大的一件事情。而预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。
根据统计培养细胞产生的污染源，常常来自于不洁的环境和不规范的实验操作，比如受污染的培养基、试剂或仪器。因此，一般预防可从以下几方面着手：
（1）在培养液中添加抗生素。
可以在培养基中事先加入双抗（硫酸链霉素和氨苄青霉素）。但双抗有时会影响细胞的状态，所以在做转染、检测细胞某项指标前一定要撤去双抗，以避免影响实验结果。
（2）从消毒灭菌着手
①细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。
玻璃吸管和玻璃培养瓶的消毒：1)高压蒸汽灭菌15分钟以上；2)干烤消毒140℃ 2小时以上。
培养基(pH7.2)和血清配制好后要做无菌试验：将血清按10%加入培养基内，用无菌的玻璃离心管或玻璃瓶取完全培养基5-10ml置培养箱内培养2-3天，肉眼见无浑浊或沉淀等异物。分装后置4℃保存。
②操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
定期清洗或更换超净台过滤膜、预滤网。
CO2培养箱的清洁是较易被忽视的地方，应1-2个月对培养箱定期进行清洁消毒。先用75%酒精擦拭培养箱内壁、隔板、水盘2-3次，用双蒸水清洗，再用酒精棉球擦拭一遍，最后紫外灯照射1h以上或进行高温高压灭菌处理。水盘内加入无菌水（应每周更换），待培养箱内温度、湿度、CO2浓度稳定后再放入细胞。
③实验环境的彻底消毒
甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂，其水溶液和气体对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
（3）规划实验操作
虽然，养细胞的步骤很简单无非是换液、传代、冻存、复苏。但是具体有好多小细节需要注意....
进入实验室环境时，佩戴好口罩及手套，穿上洁净实验服，避免灰尘或唾液进入培养物中。
超净台用紫外灯照射30-60min，并开启超净台风机运转5-10min，然后用75%酒精球擦拭超净台台面，再开始实验操作。
进入超净台前应用75%酒精对双手及手腕进行全面擦拭，确保除菌完全。
实验用品用75%酒精擦拭后才能放入超净台内。生物安全柜和超净工作台里的东西能少尽少。东西过多会干扰气流，反而更不安全，并且在物品的摆放要有一定的顺序分区要规划好。这样细胞在生物安全柜或者超净台才能安全。
操作动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要说话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
操作时小心取用无菌物品，应避免污染。勿碰触吸管尖头，不小心碰触后应立即更换；手及物品不要在暴露的瓶口上方来往，容器打开后，倾斜45度操作，操作完成后及时盖上瓶盖。
操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。
实验用品用完应移出超净台，以利于空气流通。
（4）防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分，即使不同细胞使用相同的培养基也不要共享同一瓶培养基，避免细胞间的交叉污染。
每次操作最好只处理一种细胞，多种细胞多种操作一起进行时易发生不同细胞间的污染；
（5）所有新购入或接入的细胞，必须及时保种冻存，一旦发生污染可重新复苏细胞，继续培养，这是抵御污染最直接有效的办法。
养好细胞的方法就一种，就是细心，在操作上下功夫
参考：
【1】Contamination hits cell work，DOI: 10.1038/511518a
【2】动物细胞培养——基本技术和特殊应用指南
【3】《细胞污染及检测鉴定》
【4】《细胞培养过程中支原体污染的检测及预防》
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