原生动物因为其高度灵活的基因组,使它们能够适应多种宿主并逃脱宿主的免疫。Smart-seq方案,如Smart-seq v4/ Takara、Smart-seq2、Smart-seq/C1,已被证明是通过最大限度地减少脱落来生成哺乳动物细胞scRNA-seq的一些最稳健方案。由于它们通常比其他方案更敏感,已被用于研究原生动物寄生虫疟原虫和锥虫的转录组。
与原生动物不同,真菌有细胞壁,每个细胞只有1~3pg的总RNA(比哺乳动物细胞少10倍),因此需要特殊的RNA提取程序。最近的报道介绍了三种在酵母模型生物上实现scRNA-seq的方法:Smart-seq/C1、YscRNA-seq和SCRB-seq。
细菌的RNA含量比单个哺乳动物细胞和真菌的RNA含量低10到100倍, 由于mRNA的转录物没有被聚腺苷酸化,因此将mRNA与核糖体RNA区分开来还面临另一个挑战。
多重退火和基于dC尾的定量单细胞RNA测序(MATQ-seq),通过提高逆转录效率和随后PCR扩增子的产生来增加RNA-seq的灵敏度。作为一种补充方法,微生物分裂池连接转录组(microSPLiT)和原核表达(通过原位标记RNA和测序(PETRIseq))建立在基于组合索引的scRNA-seq方案的基础上,以同时分析数千种细菌。
由于主要病原体可以在细胞内环境中建立其生态位,因此开发能够在单细胞水平上同时在宿主和细菌中执行转录组学的双RNA-seq方案将是揭示致病机制的关键。CEL-seq2是一种采用线性扩增的常用测序方法,已被用于捕获感染约10个细胞内沙门氏菌细胞的巨噬细胞的转录组;此外,研究人员还开发了专门捕获病原体的探针PatH-Cap。
由于scRNA-seq方案容易出现漏检的情况,而单分子荧光原位杂交(smFISH)仍然是定量转录物的金标准。开创性的工作已经利用smFISH在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的主要细菌模型中追踪单细胞水平的基因表达。最近的进展是开发了MERFFISH和seqFISH技术,这些技术在灵敏度和空间分辨率方面都有所提高,为开发细菌基因组级别的 FISH方法铺平了道路。