HepG2细胞培养攻略

HepG2细胞来源于一个15岁白人的肝癌组织。该细胞分泌多种血浆蛋白：清蛋白、α2-巨球蛋白、血纤维蛋白溶酶原、铁传递蛋白等。该细胞能大容量培养，乙肝表面抗原阴性，对G418有抗性，对人生长激素有刺激反应。

HepG2细胞广泛应用于遗传毒理学试验、外源性生物性异物的细胞毒性、乙型肝炎病毒感染机制、病毒培养等方面的研究。由于其与肝细胞具有相同的生物学活性，还被用于胰岛素抵抗的研究。

细胞名称：人肝癌细胞

细胞简称：HepG2

种属来源：人

组织来源：肝

疾病特征：肝癌

细胞形态：上皮细胞样

生长特性：贴壁生长

培养体系：MEM+10%FBS+1%Glutamax+1%NEAA+100mM Sodium Pyruvate+1%P/S

传代比例：1:2-1:4，每2-3天换液一次

传代周期：72-96 h

培养条件：气相：95%空气+5%CO2，温度：37℃

冻存条件：60%基础培养基+30%FBS+10%DMSO，液氮储存

传代：吸去培养液。用 0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。加适量的细胞到新的培养器皿中。（以1:4至1:6为宜，传代期间培养液每周更换2次）

注释：该细胞表达3-羟基-3-甲基戊二酸辅酶A还原酶和肝甘油三酸脂脂肪酶。该细胞在有百草枯(英文名：gramoxone)的环境下过氧化氢酶mRNA表达增加，ApoA-I mRNA 表达减少。

HepG2细胞培养的最佳培养条件

1. HepG2细胞的复苏条件

1.1 复苏温度的选择

细胞复苏：快速将所冻存细胞40℃水浴摇床60转/ min慢摇至其溶解，溶解后马上转入 37 ℃水浴箱，手工慢摇恒温 2～3min复苏 ,复苏后 800 转/ min 离心 5min,吸去上清加入 10ml 含 15%胎牛血清 DMEM 培养基 ,混匀后加入细胞培养板 ,每孔 1 ml，5%CO2温箱 37℃培养。

与传统 37 ℃水浴方法复苏后细胞存活率为 68.4% 相比较，先40℃溶解后再37℃恒温方法复苏的细胞存活率为85.7%，优于传统方法。

1.2 复苏用培养基的选择

使用RPMI-1640和DMEM两种培养基对HepG2细胞进行培养，结果发现，用DMEM培养基培养的细胞结果在接种密度为1×104/c㎡、血清含量为15%时，经6h培养后细胞开始贴壁，12h后大部分细胞贴壁，且增值速度最快，4d后可以按1:3的比例传代。而用RPMI-1640培养基培养的细胞在接种密度为1×104/c㎡、血清含量为20%时，经6h培养后细胞贴壁不明显，但12h后部分细胞贴壁，24h后亦大部分细胞贴壁，且增值速度相对较慢，5天后可以按1:3的比例进行传代。以上结果说明，使用DMEM培养基既可以节省血清，细胞贴壁所用时间短、增殖速度快，并且传代细胞培养也使用DMEM培养基，使用DMEM培养基进行复苏，避免了配制不同培养基所带来的麻烦，因此在HepG2细胞复苏中推荐使用DMEM培养基。

1.3 复苏时的接种密度

研究发现当接种密度为1×104/cm2，血清含量为20%时, 细胞24h后大部分贴壁, 且增殖速度最快, 5d后可按1:3比例传代；当接种密度大于1×104/c㎡和（或）血清含量少于20%时, 细胞表现为贴壁困难, 出现进行性退化; 当接种密度小于1×104/c㎡ 血清含量为20%时, 细胞24h后大部分贴壁, 但增殖速度明显减慢, 约7d后才可按1:3比例传代。

2. 消化酶及消化时间的选择

如果用EDTA+胰酶的消化能力太强，消化时间不好把握，传代消化后细胞死亡较多；单用EDTA消化能力太弱，消化时间太长且不易将细胞消化完全；用PBS将细胞洗3次，再加入 0.25%胰酶，覆盖细胞约30s后吸去胰酶，37℃放置 2～3 min，显微镜下可观察到细胞消化适度。

将待传代细胞不用PBS洗涤和用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后分别用0.25%的胰蛋白酶溶液、0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化（消化液用量为盖满瓶底），观察时间为30秒、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10分钟。

结果发现：不用PBS洗涤的细胞分别用上述两种酶消化，10分钟后细胞仍然消化不完全。用pH7.2的PBS洗涤一遍、二遍、三遍后的细胞，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化时，分别经3分钟、1分钟和0.5分钟能完全消化好细胞。而用0.05%胰蛋白酶-0.53mmol/L EDTA.Na溶液进行消化时，完全消化好细胞约需3分钟、1.5分钟、1分钟。二者的结果相符。

根据上述结果可知，在进行HepG2细胞的消化时，先用pH7.2的PBS洗涤三遍后，再用0.25%的胰蛋白酶溶液消化0.5分钟效果比较好。

另一种推荐使用的消化方法如下：用1×PBS将细胞洗涤2次 再加入适量的0.15%胰蛋白酶（含有0.02%EDTA并以7：3的体积比混合）覆盖细胞约20秒后吸去胰蛋白酶 （含有0.02%EDTA并以7：3的体积比混合）。

3. 培养基中血清浓度的选择

由于人肝癌细胞株生长缓慢，恶性程度较高，对于血清的要求比较严格，其培养时所需要胎牛血清的浓度要比一般的肿瘤细胞高一些。在含15%胎牛血清的DMEM培养基中HepG2人肝癌细胞生长迅速。血清含量为20%时, HepG2细胞贴壁后增殖速度最快。当HepG2细胞增殖数代后, 待其状态稳定时, 可将血清含量逐渐降至10%。

4. 双抗浓度的选择

正交实验优选发现，双抗浓度为0.5%时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长。

5. 培养基pH条件的选择

复苏细胞和传代细胞在pH6.8-7.4、5%CO2条件下培养，其贴壁和增值速度无明显变化。而无CO2条件下培养时，复苏细胞在不同pH值条件下均表现为培养液逐渐变碱性，细胞不能贴壁，且逐渐缩小，退化；传代细胞在不同pH值条件下培养，其培养液逐渐变酸性,当pH值﹥7.0时，经24h培养后，细胞基本贴壁，但增值缓慢，经48h培养后大部分细胞已伸出伪足，细胞数量明显增多；当pH值﹤7.0时，细胞贴壁困难，经72h培养后，细胞缩小、呈退化趋势。王爽等通过正交实验优选发现，pH7.2时传代效果较好，条件易于控制，且细胞能顺利生长。

6. 细胞传代条件的选择

HepG2 细胞生长至汇合度50%～95%时是对数生长期,死细胞相对较少;而当汇合度达到 100%时 ,生长趋于平台期 ,死细胞数开始增加;特别是汇合度 100%以后再继续培养,死细胞数明显增加而活细胞数减少。因此 HepG2 细胞培养最佳的传代时期是在汇合度 95%～100%之间为最佳。