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细胞中的小黑点是如何产生的?如何避免?
在正常培养细胞的情况下,我们时常会发现细胞出现一些小黑点,有些小黑点随着细胞数量的增长而增长,有一些则不会,那么这些小黑点到底是什么?会影响细胞增长吗?| 细胞培养中出现的小黑点可以分为以下几类:
1. 细胞碎片 在细胞培养中不合适操作引起的化学或物理上的刺激,例如胰酶消化时间过长,会导致细胞死亡,从而产生很多碎片。2. 凋亡小体 在体外培养条件下,细胞很容易受到环境改变的影响,诱发细胞的凋亡,产生凋亡小体。3. 血清中的沉淀经过热处理的血清中,作为常见沉淀物质的磷酸钙会显著增多,且由于布朗运动会看上去可以活动。4. 支原体污染由于支原体的污染,导致出现的小黑点,明显影响细胞增长。
| 细胞培养过程中如何避免产生小黑点?
悬浮细胞:收集细胞上清慢速离心(500~600 rpm/min,5~6 min)并更换新的培养瓶。贴壁细胞:
将细胞用 PBS 洗 2~3 遍,洗的时候,轻轻拍打培养瓶,让贴壁不牢的碎片和颗粒脱落,再弃去 PBS,消化时先加低浓度的胰酶如 0.05% 胰酶消化 1 min 左右,让细胞间隙中的颗粒和碎片脱落下来,去掉低浓度胰酶,然后正常消化细胞,将收集的细胞悬液慢速离心(500~600 rpm/min,5~6 min)并更换新的培养瓶,并可以尝试适当增加血清浓度进行培养。如果怀疑黑点是支原体污染,可进行支原体检测,检测阳性请及时将细胞处理后丢弃。比较珍贵的细胞,可以尝试使用支原体清除剂去除,并与其他细胞分开培养。
小黑点和微生物污染的区别
细胞碎片/分泌物微生物污染
形态
大小不一的黑色圆点,或不规则形状
圆球状或杆状,形态非常规则
是否运动
原地震动,布朗运动或相对液体静止
快速游动,快速转圈或相对液体静止
分布情况
视野中分布无规律
视野中分布均匀
增长情况
无抗生素条件下不增多或缓慢增多
无抗生素条件下48-72小时内爆发式增多
| 注意事项:
1. 掌握细胞传代的最佳时机,不要细胞长老了再传代;
2. 掌握好消化时间,防止消化过度产生细胞碎片;
3. 减少血清等试剂的冻融次数;
4. 将培养液的 PH 调到最佳;
5. 严格控制水质和器皿的清洁。
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