精准医学时代下的EGFR突变检测

        在美国国立卫生研究院（NIH）的官网中提到，所谓精准医学指的是疾病预防与处置的新方法，该方法需要考虑患者在基因、环境以及生活习惯方面的个体差异。之所以提出精准医学这样的概念，是因为越来越多的临床证据表明，根据患者的基因状态而采取的针对性治疗，其效果要远远优于传统的治疗策略，而在这方面非常具有代表性的例子就是非小细胞肺癌（NSCLC）的EGFR 突变。本文就精准医学时代下的EGFR 突变检测方面进行阐述，以飨读者。

        自2004 年New England Journal of Medicine 和Science 杂志的两项研究相继发现EGFR 突变与NSCLC 患者使用酪氨酸激酶抑制剂（TKIs）的疗效密切相关以来，后续的多个大型临床研究，包括IPASS、WJTOG3405、OPTIMAL、EURTAC、FASTACT-2、以及IMPRESS 等均从各个角度进一步证实了EGFR 突变对于TKI 药物的指导价值：突变阳性患者的TKI 有效率高达70%以上，而总生存（OS）可以超过30 个月，远远优于单纯使用化疗药物的时代。正因为如此，EGFR的突变状态已成为临床医生为NSCLC 患者制定治疗方案的重要依据，美国国家癌症网络（NCCN）的NSCLC 临床实践指南（Version 4.2016）以及我国卫计委发布的原发性肺癌诊疗规范（2015 年版）均已明确要求将EGFR 突变作为NSCLC 患者的必要检测。

EGFR 突变检测不得不遵循的几个原则

        只有精准的检测结果才有可能精准的指导患者治疗，由于EGFR 突变检测有一些自身的特点和要求，为保证其结果的可靠性，有几个重要的原则必须要遵循：首先，EGFR 突变是一种体细胞的突变，与胚系突变所不同的是，这种突变不能遗传后代，只发生于肿瘤细胞内。因此，必须取到足量的肿瘤细胞或肿瘤来源的核酸才可以保证检测结果的准确；其次，EGFR 突变检测需要经过PCR 扩增，这是一个指数级增长的扩增过程，一旦处理不当，将会造成气溶胶污染，影响检测结果的可靠性。因此，除了采取必要的防污染措施之外，还需尽量选择不用打开反应管的检测方法；最后，检测的样品是具有异质性的，发生突变的细胞或DNA 在检测样品中所占的含量一般很少，由于PCR 过程中会存在竞争性抑制，如何保证含量较少的突变DNA 能够有效扩增至可以检测的范围就显得尤为重要。

EGFR 突变检测方法探讨

能够取得足够组织标本的EGFR 检测

        目前已知的EGFR 突变检测方法有很多种，各种方法都有各自的优势和不足。总体来讲，这些方法都可以相对人为的划分为PCR 扩增以及检测扩增效果两个过程，而根据PCR扩增的方式，可以将这些方法大致分为常规PCR 扩增以及突变特异PCR 扩增这两类。

        常规PCR检测    采用常规PCR 的检测方法包括直接测序法、焦磷酸测序法、变性高效液相色谱（dHPLC）法、高分辨率溶解曲线（HRM）法以及TaqMan 探

针法等等。这些方法命名的区别主要在于其检测扩增效果的方式所有不同，而对于扩增过程来讲，他们的共同点是对样品中DNA 的突变类型不会加以区分。由于野生型DNA 的扩增不受任何限制，突变型DNA 的扩增自然无法得到有效保证，这使得这些方法的灵敏度很难得到更进一步的提升，一般在10%～20%之间。

        突变特异PCR检测    与采用常规PCR 的检测方法所不同的是，采用突变特异PCR 的检测方法在PCR 扩增的关键步骤中采用了一些特殊的措施，能够保证样品中的突变DNA 优先得到有效扩增。这些措施主要包括：① 将野生型和突变型DNA 分隔开，分别进行扩增（数字PCR）；②消化样品中的野生型DNA（突变富集PCR）；③抑制野生型DNA 解链（COLDPCR）；④ 阻止引物与野生型DNA 相结合等等。通过这些措施，可以使得检测方法的敏感性得以大幅提升，达到1%甚至更高的水平，从而保证了检测结果的可靠性。总体来讲，综合操作流程、污染几率、敏感性、检测价格、易实时性以及临床实践的证据等多个方面进行整体衡量，ARMS 法无疑是其中最具优势的，也是目前推荐临床使用的最佳手段，尤其是在肿瘤组织标本的检测过程中发挥着重要的作用。

不能取得足够组织标本的EGFR 检测

        多数肺癌患者在发现时就已处于晚期，很难能够取到足够的组织标本进行检测。为解决这一问题，很多学者提出可以采用外周血中肿瘤来源的DNA（Circulatingtumor DNA，ctDNA）作为组织标本的替代。但是，相比于肿瘤组织标本，外周血中ctDNA 的含量是非常少的，因此对检测方法的敏感性提出了更加苛刻的要求。目前可以满足这种要求的主要有微滴式数字PCR（ddPCR）以及二代测序这两种方法。

        微滴式数字PCR（ddPCR）    ddPCR 是近几年发展起来的一种新型数字PCR，其主要技术原理是将含有核酸分子的反应体系分成上万个纳升级的微滴，其中每个微滴含有1个或数个待检核酸靶分子。经过PCR 扩增之后，逐个对每个微滴的荧光扩增信号进行检测，根据泊松分布原理以及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。由于操作简便，成本低廉，该技术在测低拷贝核酸标本中的作用受到了越来越多的关注。解放军3O7 医院的研究团队与阿斯利康中国创新中心密切合作，已经建立了检测EGFR 突变的ddPCR 方法，对比组织学ARMS 法的检测结果，该方法检测外周血标本的敏感性、特异性以及符合率分别可以达到83.3%、94%和89.5%， 最低的检测下限可以达到0.04%，展示出了良好的临床应用前景。此外，ddPCR 还有一个重要的优势是可以对待检DNA 进行绝对定量，2014 年Oxnard 等人发表在Clin Cancer Res 杂志的研究证实，这种绝对定量的动态变化与TKI 药物的治疗效果是密切相关的，这为患者疗效的动态监测提供了可能。相信随着未来更多临床证据的出现，这项技术会为ctDNA 的EGFR 突变检测提供更多的便利，更好的指导患者的精准治疗。

        二代测序    相比于传统的直接测序，二代测序技术的优势是可以同时对几十甚至上万个基因进行序列测定，而且通过增加测序的深度，其检测灵敏度可以达到0.01%的水平，完全可以满足ctDNA 的检测要求。与ddPCR 技术一样，二代测序也可以对突变基因进行定量分析，不过ddPCR 只能检测已知突变，而二代测序对已知和未知突变均可以进行分析，其应用的领域更为广阔。然而，对于EGFR 这样的单个基因来说，考虑到二代测序的技术门槛以及检测成本都较高，采用该技术进行突变检测似乎有“杀鸡焉用牛刀”之嫌。

        因此有学者提出，在临床实践过程中，ddPCR 和二代测序的联合使用或许可以为患者的精准治疗提供更多的帮助。例如，对于刚刚确诊的患者，可以先通过ddPCR 检测EGFR 的突变状态，阳性的患者可以直接使用TKI 类药物；而对于ddPCR阴性的患者或者在阳性患者出现耐药的时间点上，可以通过二代测序检测更多的候选基因，以寻找其他的药物靶点或者分析患者的耐药机制，从而保证患者能够得到更为精准的治疗方案。

小结

        随着精准医学理念的不断普及，如何“在合适的时间，针对合适的患者，给予合适的治疗”自然成为了大家普遍关注的话题。而作为精准医疗的经典实例，EGFR 突变从其发现到在临床广泛应用的过程，给了我们很多深刻的启示，使得我们对于肿瘤发生发展的机制有了更多的认识和了解。临床诊疗的需求会不断促进检测技术的更新和完善，而检测技术的优化带来的则是更为精准的治疗以及患者生存质量的提高和生存期的延长。相信在未来，EGFR 的这种模式一定可以拓展到其他癌种的更多驱动基因，让更多的患者能够从中获益。