PMID: 36378226
2023年来自于意大利和英国的研究
注：鉴于肾素血管紧张素系统 （RAS）在白细胞中的特异性受控表达以及血管紧张素II与免疫系统的密切关系，应重新审视ACE2及AT1R与免疫系统的关系，而不是将思维局限在血管紧张性调节中。
J Exp Med. 2023 Feb 6;220(2):e20220906. doi: 10.1084/jem.20220906. Epub 2022 Nov 15.
SARS-CoV-2 Spike protein suppresses CTL-mediated killing by inhibiting immune synapse assembly
摘要：
由SARS-CoV-2感染引起的2019年严重冠状病毒病(COVID-19)与免疫失调有关，伴有IFN I型反应缺陷(Bastard et al.， 2020;Zhang等人，2020)，先天性免疫细胞的局部过度激活，适应性免疫反应受损，以及T细胞的突出作用(Chen和John Wherry, 2020;Kalfaoglu等人，2021)。T细胞缺陷包括淋巴细胞减少和功能障碍，从过度激活和衰竭到激活缺陷和分化异常(Chen和John Wherry, 2020;Kalfaoglu等人，2021)。有趣的是，与CD4+ T细胞相比，CD8+ T细胞在重症COVID-19中优先出现失调。与轻度疾病患者相比，严重疾病患者上呼吸道细胞毒性T淋巴细胞(CTL)选择性减少(Chua等人，2020年)。此外，据报道，在严重的COVID-19中，CD8+ T细胞产生的细胞因子减少(Zheng et al.， 2020)，而更强劲的CD8+ T细胞扩增与较轻的疾病或康复有关(Liao et al.， 2020;Wen et al.， 2020)。
作为效应T细胞，CTL负责消除病毒感染细胞，是病毒病原体免疫逃避的战略目标。CTL杀伤武器库的主要成分是溶解颗粒(LG)、颗粒酶富集的溶酶体样细胞器和激活后分泌的穿孔素(Cassioli和Baldari, 2022)。虽然特异性依赖于TCR与MHC I结合肽抗原相互作用的同源细胞识别，但选择性是通过在#免疫突触 (IS)上将细胞毒性效应物精确递送到靶细胞来确保的，IS是在CTL与其目标界面形成的高度专业化的信号和分泌平台(Douanne和Griffiths, 2021年;Dustin and Choudhuri, 2016)。TCR的接合触发了靶细胞接触处受体、粘附分子和共刺激受体的深刻重排，这导致了成熟IS的典型靶心结构。IS的组装由细胞骨架协调。向内的肌动蛋白流允许TCRs和共刺激受体向心运动到IS中心，最终形成一个f -肌动蛋白环，在CTL和它的目标之间密封一个空间，突触间隙。此外，中心体和分泌器官向靶细胞极化，微管为细胞毒性机制向IS的运输提供轨道，并将其输送到突触间隙(Blumenthal和Burkhardt, 2020;Martin-Cofreces和Sanchez-Madrid, 2018)。CD8+ T细胞向CTL的分化是由在感染部位被激活的DC在外周淋巴组织中启动的。因此，SARS-CoV-2对CD8+ T反应的失调很可能(至少在一定程度上)是启动缺陷造成的。然而，一旦分化，CTL就会迁移到感染部位，在那里它们可以暴露在高浓度的病毒中。研究发现，SARS-CoV-2受体人类血管紧张素转换酶2 (ACE2;Hoffmann et al.， 2020)在活化的T细胞中表达，并介导SARS-CoV-2结合和内化(Welch et al.， 2022)表明，由于Spike蛋白参与ACE2, T细胞可能被病毒直接调节。我们假设，与HIV- 1等病毒类似(Fackler et al.， 2007)， SARS-CoV-2可能以IS装配为目标，并作为逃避CTL介导杀伤的手段。我们提供的证据表明，Spike抑制IS在CTL中的组装，导致细胞毒性和细胞因子产生受损。这种效应依赖于ACE2相互作用，并可由ACE2配体再现，确定配体结合的ACE2作为CTL激活中的抑制性受体和SARS-CoV-2免疫逃避的靶点。
结果与讨论
CTL表达Spike受体ACE2
虽然已报道活化的T细胞表达Spike受体ACE2 (Welch et al.， 2022)，但尚未研究这种情况是否发生在CTL中。我们从健康供体的粉红色外套中通过负选择免疫纯化的CD8+ T细胞中生成CTL，并在IL-2存在的情况下使用包被antiCD3和anti-CD28单抗的珠子激活它们(图S1 A)。在这些条件下，CD8+ T细胞在第5天分化为功能性CTL，通过颗粒酶B (GzmB)表达和细胞毒性进行评估(图S1)。定量反转录PCR (RT-qPCR)和免疫印迹分析显示，ACE2在新纯化的CD8+ T细胞中检测不到或几乎检测不到，但在CTLs中表达强烈上调(图1,A和B)。与ACE2表达一致的是，Spike与CTLs结合，而不与新纯化的CD8+ T细胞结合。由武汉Spike (Spike W)孵卵并用抗Spike单抗标记的CTL成像评估(图C)。这一点由荧光标记的假病毒颗粒(最小病毒粒子，MiniVs)孵卵的CTL成像证实，这些假病毒颗粒在体外使用小单层囊泡组装，脂质成分调整为类似病毒粒子脂质膜和Spike W外畴(Spike /颗粒约18-40个拷贝;Staufer等人，2022;图1 D).
Spike抑制IS形成和CTL介导的细胞毒性
为了验证Spike与ACE2结合通过靶向IS调节CTL功能的假设，在20°C下用不同浓度的Spike W预处理CTL 30分钟，以允许结合，但不允许内化，随后与Raji B细胞混合，混合葡萄球菌肠毒素a, B和E，以广泛覆盖TCR Vβ库。这是使用多克隆人T细胞时通常用于is组装成像的实验设置。实验在没有血清的情况下进行，以排除循环血管紧张素(Ang)的潜在影响。在与靶细胞接触15分钟后，通过测量与APC接触的T细胞界面上酪氨酸磷酸化蛋白和TCR/CD3复合物的积累来评估功能性免疫突触的组装，这是IS获得其特征结构的时间点。研究发现，Spike以剂量依赖的方式抑制CTL产生的具有信号功能的免疫突触，如在IS处显示PTyr染色的偶联物频率降低和酪氨酸磷酸蛋白突触积累受损所示(图1、E和F;视频1 2 3;(图S1, D, E)。Spike还抑制了IS处TCR/CD3的积累(图1,E, G;和视频1、2和3)，说明下游信号缺陷。用miniv预处理CTL时也得到了类似的结果(图1,H和I)。TCR信号在T细胞与同源APC接触后立即开始，并在IS成熟的整个过程中持续。为了了解Spike是否在IS成熟的早期阶段干扰TCR信号，我们比较了CTL预处理与Spike W对IS在5分钟(新生IS)和15分钟(成熟IS)缀合物组装的结果。磷酸酪氨酸信号的缺陷和TCR/CD3在IS处的聚集在5分钟内可以明显检测到(图2,A和B)，这表明Spike W在IS形成的早期阶段就损害了TCR信号。与这一发现一致，在Spike w预处理的CTLs中，活性ZAP-70的早期突触积累受到损害，ZAP-70是蛋白酪氨酸激酶，负责将TCR偶联到下游酪氨酸磷酸化级联(Au-Yeung et al.， 2018)。流式细胞分析证实了磷酸酪氨酸信号传导缺陷(图2d和图S1 F)。这些缺陷是由Spike对TCR信号的干扰引起的，而不是由突触接触处的空间位阻引起的，如图所示，在靶细胞伙伴缺失时，由TCR交联激活的Spike W预处理CTL中TCR依赖性Erk激活受损(图2 E)。中心体重新定位到IS对于CTL的细胞毒性效应物极化传递到靶细胞至关重要(Douanne和Griffiths, 2021)。用抗周围中心蛋白(PCNT)和抗gzmb抗体(Abs)进行染色显示，在Spike W -或miniv预处理的CTL中，中心体朝向IS的极化受损，通过测量中心体与IS中心的距离来评估(图3,A-C;视频4,5,6;此外，LG向中心体收敛，这是高效脱粒所必需的(Daniele et al.， 2011;Mentlik et al.， 2010)，在这些条件下受损(图3,A和D;视频4,5,6;）Spike对CTL脱颗粒的影响最初是通过测量LG标记LAMP1的质膜暴露来测试的，这发生在LG与质膜融合之后。在非渗透条件下，用荧光标记的抗lamp1单抗孵卵的偶联物进行评估和流式细胞术分析，Spike W预处理并不影响在sAg冲击Raji细胞存在时CTL脱粒的能力(图3 E)。Ca2+动员的TCR激活阈值非常低(Irvine等人，2002年)，这对CTL脱粒至关重要，可以解释Spike效果的缺乏，尽管TCR信号传导总体受损。然而，在使用Spike w预处理的CTL形成的sAg特异性偶联物中，LAMP1染色分布在整个质膜上，而在各自的对照偶联物中，LAMP1染色选择性地集中在IS处(图3 F)。在没有sAg的情况下，没有检测到LAMP1染色(图3 F)。因此，Spike预处理导致CTL无法进行极化脱粒。我们之前报道过CTL的极化脱颗粒对靶细胞杀伤至关重要(Kabanova et al.， 2016)，这表明Spike可能抑制CTL介导的细胞毒性。为了解决这种可能性，我们通过将Spike w预处理过的CTLs与sAg冲击Raji细胞孵育，并加载钙黄素AM，这是一种细胞渗透染料，在细胞内酯酶水解后变成荧光，并由死亡细胞释放(Kummerow et al.， 2014)。一致缺陷在LG释放,荧光钙黄绿素释放的时间进程分析靶细胞表明W飙升抑制CTL杀死靶细胞的能力在所有效应:目标(E: T)细胞比率测试(图3 G)和剂量依赖性的方式(图S1 G)。类似的结果在一个使用melanoma-specific CTL抗原系统生成的黑色素瘤患者CTL和HLAm偷走了黑色素瘤细胞系A375靶细胞。在这些实验中，我们分别用Spike W或MiniVs预处理CTL，用碘化丙啶染色18 h后用流式细胞仪检测靶细胞杀伤(图3,h和I)。为了进一步证实Spike对CTL介导杀伤的抑制作用，我们生成了过表达Spike W的A375细胞转染剂和空的载体对照转染剂，并测试了它们对CTL功能的影响能力。Spike过表达的黑色素瘤细胞总结了Spike预处理对CTL细胞毒性的抑制作用(图3 J)。因此，Spike W阻止CTL形成功能性免疫突触，导致溶解颗粒LG极化受损，并在IS处释放，从而降低其杀伤潜力。为了了解Spike是否在细胞毒性之外损害CTL功能，我们使用IFNγ作为读数评估了它们产生细胞因子的能力。在偶联形成36小时后，由黑色素瘤抗原MAGE A3脉冲的自体B细胞激活的黑色素瘤特异性CTL上清液中的IFNγ定量显示，可溶性Spike预处理的CTL(图S1 h和图S2 a)或MiniVs(图S2 B)的IFNγ产生减少。当黑色素瘤特异性CTL与过表达Spike的A375细胞混合时，也得到了类似的结果(图S2 C)，这表明Spike对CTL具有持久的抑制作用。
Spike对IS形成的抑制作用由ACE2介导，可在急性感染的SARS-CoV-2患者中检测到。
为了深入了解Spike对CTL IS组装和功能抑制活性的机制，我们将分析扩展到Spike变体Omicron BA.1和BA.2。这些变体概括了Spike W对IS组装的影响，通过测量酪氨酸磷酸化蛋白和TCR/CD3复合物的突触积累(图4,A和B)以及朝向IS的中心体极化(图4 C)进行评估。由于Omicron Spike变体携带的突变不会损害ACE2结合(Wrapp等人，2020;Yin et al.， 2022)，这一结果表明Spike对CTL的影响是由ACE2介导的。与这一观点一致，使用Spike W或Spike Omicron BA.1对CTL进行预处理，在特定中和单克隆抗体的存在下，可以防止Spike与ACE2结合(Andreano等人，2021a;Andreano等人，2021b;Torres等人，2022)通过CTL逆转了Spike变体对IS组装的抑制作用(图4,A-D)。为了进一步阐明ACE2在Spike介导的CTL抑制中的作用，我们在新鲜纯化的不表达ACE2的静止CD8+ T细胞中研究了Spike处理的结果(图1a)。Spike不影响这些细胞中的IS组装(图S2, D-F)。然而，ACE2的过表达使静止的CD8+ T细胞对Spike产生反应(图4,E和D)。因此，Spike对IS形成的抑制作用是由ACE2特异性介导的。为了在SARS-CoV-2感染的背景下验证这些结果，我们评估了急性感染患者中自然暴露于Spike的CTL形成功能性免疫突触的能力。来自三名急性感染患者的支气管肺泡灌洗液(BAL)和匹配的外周血淋巴细胞(PBL)，以及来自健康供者的对照PBLs，与sAg冲击Raji细胞混合，并用于评估其组装功能性免疫突触的能力，通过成像APC接触处的酪氨酸磷蛋白积累进行评估。CTL被标记有抗gzmb单抗的lg所歧视。研究发现，这些患者的BALs(而不是PBLs)在缺乏外源添加Spike的情况下，在IS信号转导方面表现出严重缺陷，这与使用Spike治疗的健康CTL中观察到的情况相似(图4 F)。尽管其他因素可能导致这种表型，但这些数据强烈表明，急性感染期间，在体内的CTL暴露于呼吸道中的Spike会损害其形成功能性免疫突触的能力。
ACE2的参与损害CTL IS的形成和细胞毒性
ACE2是一种I型跨膜锌金属蛋白酶，在肾素-血管紧张素系统(RAS)中起关键作用。ACE2的胞外羧肽酶结构域催化血管紧张素(Ang) I转化为Ang (1-9)， Ang II和Ang(1-9)转化为生物活性肽Ang(1-7)，从而激活靶细胞上的受体MAS1 (Samavati和Uhal, 2020)。然而，ACE2也作为一种受体，通过其细胞外、跨膜和细胞内结构域的独特贡献，以不依赖肽酶的方式调节细胞内过程，包括整合素转激活、氨基酸转运蛋白的调节和SARS-CoV-2的内吞作用依赖性感染(Danilczyk等人，2006;Hoffmann等人，2020;Inoue等人，2007;Simons等人，2021)。为了阐明ACE2如何介导Spike对IS形成的抑制作用，我们首先使用转染ACE2- gfp编码结构或对照gfp编码载体的CD8+ T细胞研究了ACE2在sAg特异性缀合物中的定位。在没有Spike的情况下，ACE2被发现在IS中积累(图5a)。有趣的是，当Spike存在时，ACE2向IS的募集被削弱(图5a)，这表明ACE2配体可能通过阻止其正确定位来调节IS的组装。
接下来，我们利用抗ACE2多克隆抗体作为配体，评估了ACE2在CTL中参与IS组装的结果，这种抗ACE2多克隆抗体对抗细胞外结构域，通过与Spike竞争ACE2结合来阻止SARS-CoV- 2进入靶细胞(Hoffmann et al.， 2020)。抗ACE2抗体的CTL预处理再现了Spike对IS组装的抑制作用，包括酪氨酸磷酸化蛋白和TCR/CD3复合物的突触积累(图5,B和C)，中心体向IS的极化(图5 D)，以及LG向中心体的收敛(图5 E)。在这些条件下，CTL介导的杀伤(图5,F和G)和IFNγ的产生(图S3 A)均被抑制。与Spike相似，通过分析5分钟和15分钟内CTL -靶细胞缀合物形成的免疫突触，抗ACE2 Ab抑制了成熟早期CTL中信号功能免疫突触的形成(图S3, B-D)。新鲜纯化的CD8+ T不表达ACE2(图1a)，用抗ACE2 Ab(图S3, E-G)预处理后，未观察到对IS组装的影响。值得注意的是，虽然血管紧张素II (Ang II)抑制CTL中功能性免疫突触的组装，类似于抗ACE2 Ab，但当细胞被Ang处理时，没有观察到任何影响(1-7;图5,B-E)，排除了ACE2在这一功能中的催化活性以及Ang(1-7)受体MAS1介导的间接作用。值得注意的是，虽然MAS1在CD8+ T细胞中表达，但在CD8+ T细胞分化为CTL的过程中，其表达下降(图S3 H)。综上所述，这些结果支持配体结合后，ACE2传递抑制信号以抑制IS组装的观点。
SARS-CoV-2的免疫逃避机制
总的来说，我们的结果为SARS-CoV-2的免疫逃避机制提供了新的见解，涉及Spike-ACE2轴，作为受感染细胞避免杀伤的一种手段。我们认为，我们在体外观察到的影响可能与SARS-CoV-2感染的生理环境有关，急性感染患者CTL中的IS缺陷有力地支持了这一点。值得注意的是，据计算，在感染期间，体内个体在痰中携带高达1011个病毒粒子/ml (Bar-On等人，2020年)或在肺中携带1011个病毒粒子(Sender等人，2021年)，这转化为~ 4 μg Spike蛋白，这与我们在体外使用的数量范围相同。鉴于病毒在上皮细胞水平繁殖，我们认为Spike的局部浓度可能很容易超过我们体外实验中使用的水平。此外，虽然可溶性Spike能够抑制CTL IS的组装和细胞毒性，但每个病毒在其表面显示约60个Spike三聚体副本，这可能通过受体聚集来放大信号。为了支持这一观点，携带约18-40个三聚体Spike拷贝的miniv (Staufer et al.， 2022)以比可溶性三聚体Spike低>两倍的浓度抑制IS组装和CTL功能(图1 H)。
Spike抑制IS组装的机制仍有待阐明。我们的数据显示SARS-CoV-2 Spike蛋白与ACE2结合，通过在早期抑制这一过程来干扰CTLs中功能IS的组装，同时ACE2从IS中被排除。ACE2-Spike轴的潜在靶标是整合素，如LFA-1，它对于生成结构良好的免疫突触至关重要，其特征是在与APC接触区域的中心紧密聚集TCR/CD3复合物(Cassioli等，2021a)。据报道，ACE2可与β1和α5整合素相互作用，促进细胞粘附并调节下游信号传导(Clarke等，2012;Lin et al.， 2004)。ACE2是否与T细胞整合素结合并调节信号仍然是一个悬而未决的问题。这一发现表明，在配体缺失的情况下，ACE2可能通过促进整合素依赖的粘附来促进IS的组装。
值得注意的是，在ACE2结合位点附近，Spike显示一个保守的RGD序列，即共识整合素结合基序(Sigrist et al.， 2013)。实验证据支持β1和αv整合素可能与ACE2一起作为替代Spike受体或共受体的观点(Norris等人，2022预印本;Park等人，2021)。在机制上，Spike已被证明可以通过激活Gα13和适配器talin介导的由内向外的信号通路来调节肾细胞系Vero E6中的β1整合素信号通路，以促进生产感染(Simons et al.， 2021)。此外，Spike ACE2结合域内的RGD序列最近被确定为原代人气道上皮细胞中的αv选择性整合素激动剂，通过激活激酶FAK和Src以及接头paxillin，触发细胞扩散、局灶性粘连的形成和肌动蛋白重组(Norris等，2022预印本)。然而，整合素激活是IS组装开始所需的关键激活事件(施普林格和Dustin, 2012)，而Spike抑制了这一过程，这一事实强烈表明Spike对CTL IS的抑制作用不是由整合素介导的。此外，我们的数据显示，Spike Omicron BA.2变体在RGD整合素结合基序映射的403-405位(RGN)的405位进行了非保守的D到N替换，在抑制IS组装方面与Spike W和Spike Omicron BA.1一样有效。相反，单抗阻止Spike与ACE2结合的能力，以及在新鲜纯化的CD8+ T细胞中缺乏任何Spike对IS组装的影响，这些细胞不表达ACE2，但在强制表达ACE2后获得了对Spike的易感，突出了ACE2在Spike依赖的IS组装抑制和CTL介导的杀伤中的关键作用。
虽然ACE2作为一种参与RAS的外位酶的作用已被广泛描述，但其跨膜和细胞内结构域的作用(它们与集素共显示48%的同源性)才刚刚开始被探索。这两个结构域都涉及SARS-CoV-2感染，通过spike介导的ACE2细胞外结构域结合后病毒的内吞摄取(Hoffmann et al.， 2020;Inoue et al.， 2007)。此外，收集素同源结构域已被证明可作为伴侣，稳定肠上皮细胞表面的大型中性氨基酸转运蛋白，以调节氨基酸吸收(Camargo等，2009;Kowalczuk等人，2008)。细胞内结构域还通过与钙调素相互作用，调节TACE/ ADAM17介导的细胞外结构域向其催化活性可溶性形态的脱落(Lambert et al.， 2008)。值得注意的是，由于ACE2的表达，CTL可能对SARS-CoV- 2感染易感，事实上，这种可能性已在完全激活的外周T细胞中得到证实(Welch et al.， 2022)，这表明CTL可能首先被IS的Spike靶向禁用，然后被新招募到感染部位的CTL杀死。
ACE2配体对TCR信号通路和IS组装的抑制作用，而不是其催化活性产物Ang(1-7)的抑制作用，支持了ACE2通过响应配体结合而触发的信号以一种不依赖肽酶的方式限制CTL激活的观点。由于抗ACE2抗体在细胞和动物模型中已被证明可以有效限制SARS-CoV-2的产生(Chen et al.， 2021;Chaouat等人，2022)，我们的研究结果提出了在COVID-19患者中使用抗ACE2抗体作为治疗方法可能导致不必要的免疫抑制的可能性。
值得注意的是，已在T细胞中记录了功能性RAS (Coppo等，2011)。在RAS成分中，据报道Ang II受体AT1对T细胞具有免疫调节作用，在血液期疟疾期间限制有害的CD8+ T细胞反应，并在高血压患者的肾脏中促进保护性CD4+ T细胞反应(Silva-Filho等人，2016;席尔瓦- filho等人，2017;Zhang等人，2012)。这表明ACE2可能通过其酶不依赖性和酶依赖活性参与T细胞免疫。
其他病毒也将T细胞IS作为逃避免疫监视的目标。最显著的例子之一是HIV- 1，它利用毒力因子Nef破坏了关键信号成分协调运输到IS所需的囊泡运输过程，导致T细胞对病毒产生非生产性反应(Fackler等人，2007年)。重要的是，IS还充当其他免疫细胞(包括辅助T细胞和B细胞)的信号和细胞-细胞通信平台(Batista等人，2001;Chemin等人，2012;Papa and Vinuesa, 2018)。本文报告的数据强调了一种有趣的可能性，即SARS-CoV-2可能利用IS靶向作为一种广泛的免疫调节策略，而不仅仅是抑制CTL功能，以逃避宿主的适应性免疫反应。
联系客服
