外泌体是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，直径约 30-150nm，细胞经过“内吞融合-外排”等一系列调控过程而形成细胞外纳米级小囊泡。外泌体内含有丰富的蛋白质、 脂类、和复杂 RNA( mRNA, ncRNA, miRNA, rRNA )，表面有特异性蛋白。外泌体天然 存在于各种体液中，如外周血、 唾液、尿液、腹水、羊水、脑脊液、乳汁等。外泌体从 发现至今已有 30 多年的历史，最初被认为是细胞的“垃圾”，此后发现，外泌体是具有功 能活性并可进行细胞间信息传递的分泌微囊泡。2013 年的诺贝尔生理学医学奖授予美国 科学家詹姆斯·罗斯曼、兰迪·谢克曼和德国科学家托马斯·苏德霍夫，以表彰他们在发现 细胞囊泡运输系统及其运行调节机制研究中做出的杰出贡献。这种细胞外囊泡样结构就 是外泌体。
开发高效、快速、稳定，并且保持外泌体结构和生物功能完整性的方法，是目前外泌体应用于临床的基础和前提。从细胞上清和体液中提取分离外泌体的方法很多，但是外泌体的纯度和产量却和分离方法息息相关。通常分离步骤少、产率高，但是纯度会受到影响。鉴于每种分离方法都有其优缺点，实验可以根据样本来源、下游实验目的等，选择合适的外泌体分离方法。2015年，国际囊泡组织(Internation Society for Extracelluar Vesicles, ISEV)指出，简单依靠一种分离方法得到的外泌体的纯度和产量都难满足实验的需求。因此，推荐联合使用各种方法，从而得到高纯度和高产量的外泌体。本文总结了常用的传统和新兴的外泌体提取方法。
一、超速离心法
常用的是超高速离心法，该方法是被誉为分离外泌体的“金标准”。该方法利用离心力从细胞培养液或生物流体获得外泌体，经过400×g、2000×g、10 000×g的低速离心，除去细胞及大的细胞分泌物；最后超高速100 000×g离心得到外泌体。超高速离心因操作简单，不需要复杂的技术支持，并且成本相对较低而被广泛使用。但是该方法耗时、产率低，得到的外泌体的数量和质量很大程度上受转子的类型、转子沉降角度等因素影响，其中最主要的问题就是差速离心法获得的沉淀物是外泌体，但也会有其他的囊泡、蛋白质或蛋白和RNA的聚集体。
二、密度梯度离心法
研究发现，外泌体的密度在1.1~1.19 kg·L之间，因此，可以采用密度梯度离心法来分离外泌体。该方法是将超速离心结合蔗糖密度梯度或蔗糖垫结合，原理是先除去非囊泡物质，再通过梯度密度浓缩提取外泌体，该方法可以得到相对较为纯净的外泌体。传统的梯度密度方法通常需要离心16 h，但是2012年，研究者使用了62~90 h才分离出某些确切囊泡，因此，该方法可能不足以沉淀所有的外泌体。如果离心时间不充足，污染物质可能和外泌体保持在相同的密度层，特别是这个密度范围又比较宽。
三、聚合物沉降法
这种方法是通过高分子的疏水聚合物，如聚乙二醇（PEG），它可以改变外泌体的溶解性和分散性，使其能够在比较低的离心力下沉降出来。其原理可能与竞争性结合游离水分子和PEG本身形成的网状结构有关。这种方法的优点就是操作起来比较简单，不需要超速离心机，得到的外泌体数量较多，也适合大剂量的样品处理。但是这种方法提取得到的外泌体，杂质含量会比较多，尤其是一些杂蛋白。
四、分子排阻法
这种方法主要是利用多孔的凝胶球，通过分子大小不同将外泌体纯化出来，其原理类似层析法纯化蛋白。在分离提取过程中，大分子物质不能进入凝胶孔，很快沿多孔凝胶间的缝隙被流动相洗脱出来，而小分子物质能进入凝胶孔，滞留时间更长，会更慢地被洗脱出来。外泌体的分子粒径大于一般的蛋白分子，所以外泌体会先被洗脱下来，而粒径小的蛋白质会被后洗脱下来，从而分离出高纯度的外泌体。优点就是纯度相对较高，且外泌体结构不易受到破坏。缺点就是如果有一些大小相近的颗粒也会被纯化出来，比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。
五.尺寸排阻色谱法和超滤法
尺寸排阻色谱法是利用分子筛理论，最初是根据蛋白质分子大小分离蛋白质的色谱技术。该方法的主要优点是不需要很大的离心力，从而保证了外泌体的完整性。Mol等[13]对比超高速离心和尺寸排阻色谱法得到的外泌体蛋白，结果显示，后者得到的外泌体的蛋白丰度高于前者。这些基于过滤或尺寸排阻色谱的新方法为外泌体大规模的生产和临床应用提供了可能。
超滤也是根据外泌体的尺寸将其分离出来的一种方法，超滤一般被认为是外泌体分离过程中的一个准备过程，通过超滤除去大分子和小分子的蛋白质。不过连续的超滤可以分离出外泌体，和超高速离心相比，超滤不需要特殊的设备就可以较短时间内分离出外泌体。但是，超滤膜对外泌体的黏附作用会降低外泌体的产量，并且超滤过程中施加的外力可能会使外泌体变形或者破裂。
六.磁珠特异性捕获法
外泌体表面带有许多特殊的膜蛋白质，如CD9、CD63、CD81和ANNEXIN等，可以将这些外泌体标志蛋白作为分离外泌体的特异性标记。将抗体固定于磁珠等基质上，利用相应性抗体与这些标志蛋白之间的特异性相互作用，以实现对外泌体的特异性富集。这种方法的优点是外泌体纯度较高，并且对外泌体膜结构影响较小。缺点就是成本较高，无法进行大剂量的提取，并且磁珠保存难度也比较高。
外泌体作为“货物”载体
外泌体的脂质双分子膜可以保护其在血液循环中不被降解，但是这种膜结构以及其内含各种丰富的物质，使得外泌体载“货物”变得困难。外泌体只有保证膜结构的完整性，才能不引起免疫反应，不被MPS吞噬。目前，将“货物”载入外泌体的方法主要有两种(Fig 4)：(1)前转载，在分离外泌体之前，将“货物”与母代细胞共培养和对母代细胞进行转染，可以让母代细胞分泌含有“货物”的外泌体；(2)后转载，分离出外泌体之后，将“货物”载入外泌体。
前转载
前转染主要是用转染剂将“货物”转染进入亲代细胞(或者将“货物与亲代细胞孵育”)，然后收集培养基，获得载有“货物”的外泌体的过程。该方法的主要问题是合适有效的转染试剂很少，且转染试剂无法完全去除，导致转染效率低，无法排除转染试剂对实验的影响。
外泌体载核酸类物质
Didiot等将小干扰RNA通过疏水性修饰(hsiRNA)后，与外泌体孵育，结果载有靶向亨延顿mRNA的hsiRNA外泌体可以被小鼠原代皮层神经元内化，导致亨延顿mRNA和蛋白发生剂量依赖性沉默，然后单侧注入含有hsiRNA的外泌体到小鼠纹状体，导致寡核苷酸的双侧分布，亨延顿mRNA在两侧均有35%的沉默。递送至脑的含hsiRNA外泌体广泛分布和有效性有望改善和治疗亨延顿以及其他神经变性疾病。Buscail等利用工程化手段，将来源于正常成纤维细胞间充质细胞的外泌体修饰为“iExosomes”，其可以递送小RNA，以特异性靶向突变体KRAS，导致疾病抑制，并增加小鼠模型的总体存活率。研究人员使用RNA干扰(RNAi)的靶向方法，用天然来源的外泌体递送时，抑制胰腺癌细胞中的突变体KRAS的表达，从而影响多种胰腺癌模型中肿瘤的生长和存活。与正常的脂质体相比，工程化的外泌体(iExosomes)靶向致癌性KRAS，并且他们还发现，通过外泌体表面的CD47分子可以让外泌体给巨噬细胞一个“别吃我”的信号，从而减少外泌体的损耗，提高其在血液中的半衰期，最终提高治疗效果。
外泌体载蛋白质
无论是化学试剂还是核酸，这些大分子物质都可以被成功载入外泌体中，但是载高分子质量的蛋白质却存在很大难点，重组蛋白的提纯耗时、耗钱，而且过程中因物理或者化学作用会导致蛋白变性。Yim等最近研究一种新的蛋白质载入外泌体的方法：通过可逆蛋白相互作用，促进蛋白质载入外泌体(EXPLORs)，相比其他方法，该方法的载蛋白量更高。实验过程中，在蓝色荧光控制下，有效利用可逆蛋白与蛋白之间的相互作用，将货物蛋白导入亲代细胞，然后从亲代细胞提取分离出含有目的蛋白的外泌体。因为EXPLORs是通过胞内蛋白活跃载入外泌体的，在这个过程中使用了蓝色荧光，并且整个过程不包括蛋白提纯的步骤。该课题组通过体内、体外实验均成功地转运诸如Cre recombinase一类的功能蛋白到靶细胞，他们进一步阐释，认为EXPLORs技术对于提高治疗性蛋白的装载和转运效率具有重要的意义。
外泌体载化疗药物
Ascucci等将紫杉醇(2 mg·L-1)和小鼠间充质干细胞(3×105)混合培养24 h，除去未进入细胞的紫杉醇，48 h以后收集细胞上清，超高速离心提取外泌体。高效液相色谱和红外光谱结果显示，间充质干细胞分泌的外泌体中含有紫杉醇，同时研究人员将含有紫杉醇的外泌体作用于人的胰腺癌细胞，结果显示，含有紫杉醇的外泌体有效抑制了胰腺癌细胞的增殖。另外，该课题组还发现，不同来源的外泌体具有特异性的标记，且该标记有望成为疾病诊断的靶点。
后转载
另一种常见的方法是将“货物”与外泌体孵育，鉴于外泌体的磷脂双分子层表面，该方法更适用于小分子的疏水性“货物”。对于水溶性的“货物”则常用电穿孔的方法将“货物”载入外泌体。
过去的几十年中，越来越多的研究聚焦在外泌体作为药物递送系统的可能性，但是外泌体的提取方法、纯度、产业化生产及低的载药量等，限制了其进一步的发展。未来的研究将集中在如何提高外泌体的载药量上，事实上，外泌体本就能够携带大量“货物”进入机体。外泌体的进一步修饰可以提高其活性，并且也可以根据疾病产生的细胞毒性(癌症治疗)，或保护特性(用于治疗神经退行性疾病的影响，提高治疗的效果)来修饰外泌体。新的治疗干预措施，包括扩大生产规模和控制生产质量，严格的药代动力学和毒理学研究，这些目标的实现将是后续的工业发展的关键步骤。目前，一些抗癌药物包括阿霉素、紫杉醇和基因类药物，都已经可以有效地负载到外泌体中，说明了外泌体在药物递送上的潜力。
参考文献：
1. Clotilde Théry, L. Zitvogel , and S. Amigorena . "Exosomes: composition, biogenesis and function." Nature Reviews Immunology 2.8(2002):569-579.
2. Yáñez-Mó M, et al. Biological Properties of Extracellular Vesicles and Their Physiological Functions. J. Extracell. Vesicles. 2015; 4:27066.
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4. D. Michiel Pegtel and Stephen J. Gould. "Exosomes." Annual Review of Biochemistry. 88(2019): 487–514.
5. Shao, Huilin , et al. "New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles." Chemical Reviews(2018):acs.chemrev.7b00534.
6. Clotilde Théry, et al. "Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids." Current Protocols in Cell Biology 30.1(2006).
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