有句调侃的话叫“唯有套路得人心”，在科学研究中也存在一些套路，这些所谓的套路大多是科研的逻辑性和严谨性的体现。今天我从近期的一篇Nature文章谈用RNAseq研究分子机理的“套路”。
RNAseq是把mRNA和Non-codingRNA等用高通量测序技术把它们的序列测出来，并可计算出其丰度，其中最常用的是mRNA测序，检测所有基因的转录水平。对于生物学医学现象或问题的研究，RNAseq是一项有力工具。今天讲的这篇是今年11月21日美国弗吉尼亚大学ShoMorioka等人发表于Nature杂志的文章，作者研究的生物学现象是胞葬作用（Efferocytosis）。胞葬作用是吞噬细胞将凋亡的细胞吞噬移除的过程，是机体的一种自我保护机制。下面来谈一下作者从RNAseq入手研究胞葬作用分子机理的套路。作者将吞噬细胞与凋亡的细胞共孵育发生胞葬作用后用RNAseq检测吞噬细胞的mRNA水平，同时未与凋亡的细胞共孵育的吞噬细胞作为对照组，比较两组吞噬细胞的mRNA含量变化。这是常见的RNAseq实验设计，第一步是设计一组或多组处理组，并且有相应的对照组。处理组和对照组作比较如果这个处理有效或发生了一些生物学现象，我们总能检测到表达量发生变化的基因。
第二步从细胞整体水平上观察哪些基因发生了变化以及其所归属的信号通路或生命活动等。全局检测RNA水平是RNAseq的优势，它能给我们全面的转录组信息，还会发现一些意想不到的信息。这篇文章作者也是先看了整体的mRNA变化，发现有817个基因上调，633个基因下调，聚类后发现actin重排/细胞运动、抗炎、糖酵解相关的基因上调，氧化磷酸化、脂肪酸氧化、胆固醇合成相关的基因下调，如图1所示。
图1
第三步由面入点，这是最关键的一步。所谓的面是我们已经看到的很多变化的基因，由于时间精力资金有限不可能把所有变化的基因都进行实验，所以需要挑选出其中的一些进行研究，所谓的点就是你挑选的一个（类）或几个（类）基因，这直接影响之后整个研究的走向。那么如何选点呢？可以有以下考虑：这个基因本身很重要；新颖性（这个基因和这个生命现象之前没人报道过）；相关性高（这个基因在处理组中含量变化大）；你在做RNAseq之前的一些猜测；对这个基因很熟悉实验室已经在研究这个基因等等。这篇文章作者挑选的是SLC（solute carrier）蛋白家族，这一家族是膜蛋白，是葡萄糖、氨基酸、核苷酸等的转运蛋白，重要性不言而喻。并且该蛋白家族有很多在胞葬过程有上调和下调。如图2所示。
图2
第四步用其他方法验证你挑选的基因变化的RNAseq数据是真实的。一般用QPCR验证mRNA水平或Western blot验证蛋白水平。这篇文章作者也做了。
第五步验证挑选的基因对你研究的这个生命现象有影响。通常是将基因敲低或敲除、敲低敲除后回补（rescue）、用化合物抑制或激活这个蛋白的功能、将基因过表达等，观察相应的生命现象的变化。这篇文章作者基本都做了：他们将SLC2A1过表达发现胞葬作用明显增强，用SLC2A1的抑制剂将SLC2A1功能抑制、用RNA干扰敲低SLC2A1的表达、用CRISPR-cas9敲除SLC2A1都发现胞葬作用明显降低，敲低SLC2A1再回补SLC2A1后胞葬作用得到恢复。如图3所示。
图3
第六步由点成线，照应面，揭示该生命现象的分子机理。我们挑选的基因本身可能就有一些研究清楚的功能，比如是某一通路的一环，那么可能这一通路可能与你现在研究的生命现象有关。或者我们挑选的基因相应的蛋白有和它相互作用的蛋白，那么这个和它相互作用的蛋白甚至是和它相互作用的蛋白相互作用的蛋白都可能与你现在研究的生命现象有关。这一步是由你挑选的基因出发尽可能的找出中间的信号通路等分子机制，这一步是最难的。这篇文章作者选的这个蛋白SLC2A1就是大名鼎鼎的GLUT1（葡萄糖转运蛋白），SLC16A1是乳酸、丙酮酸转运蛋白，很自然的想到糖代谢与胞葬作用有关，他们设计实验发现SLC2A1促进糖酵解，糖酵解的中间产物促进胞葬作用，糖酵解促进actin的聚合进而促进胞葬作用，SLC16A1介导的乳酸释放促进抗炎环境的形成，如图4所示。这些与最初的RNAseq全局看到的变化相互照应，有很好的一致性。
图4
以上就是用RNAseq研究分子机理的基本“套路”，这个套路也可以当作整个组学的“套路”。套路的核心是逻辑性、严谨性和可操作性，现代生物学发展如此迅猛，新技术、方法、机制的和旧技术、方法、机制一道必将更有助于生命现象的揭示以及健康问题的解决。
参考文献：
Morioka, S., et al. Efferocytosis induces a novel SLC program to promote glucose uptake and lactate release. Nature, 563(7733):714-718 (2018).
作者：李柯楠
编辑：蔡臣静
GoDesign
ID：Molecular_Design_Lab
联系客服
