蛋白激酶在许多生理过程中发挥重要调控作用，并且与许多疾病的发生密切相关，因此激酶是非常重要的药理学靶标。除了可逆抑制剂，近年来不可逆共价抑制剂的发展又重新获得业界关注，共价激酶抑制剂临床潜力巨大，近年来FDA已批准两种共价激酶抑制剂Ibrutinib (靶向BTK)和Afatinib (靶向EGFR)。尽管如此，共价抑制剂脱靶效应所带来的潜在毒性始终令人担忧，限制了其在临床上的广泛应用，因此在整个蛋白质组中的靶点分析对于共价抑制剂的发展是非常必要的。
现有的质谱法主要是蛋白水平的靶标鉴定，不能直接反映氨基酸水平的反应活性，2018年12月6日，来自Dana-Farber癌症研究院的Jarrod A. Marto团队在JACS杂志在线发表了题为"A Chemoproteomic Strategy for Direct and Proteome-wide Covalent Inhibitor Target-site Identification" 的研究论文，报道了一种鉴定共价抑制剂在整个蛋白质组中修饰位点的新策略。
作者利用共价激酶抑制剂的亲和标签类似物建立了全新的化学蛋白质组学平台CITe-Id (Covalent Inhibitor Target-site Identification)，它能够在氨基酸水平上直接反映共价激酶抑制剂的具有浓度依赖效应的结合。他们首先研究了CDK7/12/13抑制剂THZ1 (图1)，用脱硫生物素标记的THZ1 (THZ1-DTB)作为竞争性探针与不同浓度的THZ1一起与细胞裂解液进行孵育，用pulldown富集胰酶降解的肽段，再结合同位素标记和多维色谱进行分析，具有浓度依赖的THZ1竞争性结合被认为是特异性的，共鉴定出8个THZ1共价修饰的Cys位点，除了CDK7,12和13，还有PKN3(C840)、PRKCQ(C661)以及GSK3B等。
图1 CITe-Id流程示意图
THZ1的激酶靶标之一PKN3与肿瘤生长和转移有关，作为基于脂质体siRNA的治疗靶标目前正在进行临床研究，基于PKN3的临床研究价值，作者展开了进一步的研究。THZ1对PKN3的共价修饰会抑制其酶活，从而证明C840是PKN3上一个药理学可及的共价修饰位点 (图2)，并通过化合物库的筛选，获得了潜在的PKN3选择性共价抑制剂JZ128。
图2 THZ1在PKN3上的共价修饰位点
PKN3的作用机制目前尚未阐明，它的底物以及下游效应分子还不清楚。作者用JZ128和THZ1作为探针，鉴定出了PKN3的潜在底物LAD1 (S375)和EXOC2 (S432)，结果有待进一步证明。
图3 利用共价探针鉴定出的PKN3的潜在底物
综上所述，作者发展了一种在氨基酸水平上鉴定共价抑制剂靶标的新方法，该方法能够快速直接地反映出共价修饰的分子机制，与其他方法互为补充则能够更全面的覆盖蛋白质组中的靶标。同时，该方法还能够用于发现靶标上潜在的可药共价修饰位点，并有助于靶标作用机制的研究。
参考文献：
Browne CM, Jiang B, et al. “A Chemoproteomic Strategy for Direct and Proteome-wide Covalent Inhibitor Target-site Identification.” Journal of the American Chemical Society 2018 Dec 6. DOI: 10.1021/jacs.8b07911
作者：刘红博
编辑：孙翔宇
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