慢性乙型肝炎病毒(HBV)感染是引起全球肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要原因。但是,可用的抗病毒治疗无法消除绝大多数患者的HBV感染。迫切需要新的有效治疗方法。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-Cas9(CRISPR-associated nuclease 9) 系统是编辑HBV基因组并通过双链DNA断裂(DSB)减少HBV复制的有效方法。Cas9 介导的 DSB 能够导致宿主基因组不稳定,因为整合的病毒序列在慢性HBV感染患者中很常见。
最近的研究表明CRISPR碱基编辑器可以在没有DSB的情况下精确地改变单核苷酸并通过产生终止密码子(CRISPR-STOP)有效地沉默基因。但是,尚不清楚CRISPR-STOP是否可以用于抑制HBV基因表达。
来自吉林大学第一医院和明尼苏达大学的研究人员进行了一项旨在评估 CRISPR-STOP 对HBV 基因沉默的影响研究,相关研究结果发表在即将召开的2019AASLD年会上。
研究人员设计了单个向导RNA(gRNA_S)来修饰CAG(谷氨酰胺)编码HBV表面抗原(HBsAg)的HBV S基因的第30个密码子,以终止密码子TAG。通过慢病毒载体介导的转导构建稳定表达基础编辑器 AncBE4max 的 PLC / PRF / 5 细胞系。对转导的PLC / PRF / 5细胞系中整合的HBV基因组进行测序,以评估碱基编辑效率。通过酶联免疫吸附法测定转导的PLC / PRF / 5细胞系培养上清液中的HBsAg浓度。
研究结果,通过分析HBVdb数据库中的S基因序列来评估gRNA_S在HBV中的保守性。研究人员发现HBV基因型B,C,F 和 H 的 94%,92%,91% 和 71% S基因序列具有gRNA_S结合位点,表明 gRNA_S 在不同的HBV菌株中高度保守。
在用编码gRNA_S的慢病毒载体转导后,表达 AncBE4max 的PLC / PRF / 5细胞系中71%的细胞形成了提前终止密码子。重要的是,表达gRNA_S的慢病毒载体的转导诱导了PLC / PRF / 5细胞系中HBsAg分泌减少了92%。
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