巨蛋白复合体昼夜节律调控——小角散射与计算科学整合途径

概要 包括京都大学复合原子能科学研究所杉山正明教授、自然科学研究机构生命创建探究中心加藤晃一教授(兼任分子科学研究所/名古屋市立大学)、名古屋市立大学研究生院药学研究科矢木宏和副教授、柚木康弘同博士后期课程学生(现:京都大学复合原子能科学研究所研究员)、 量子科学技术研究开发机构量子生命科学研究所河野秀俊集团组长、松本淳同主干研究员、拉威朗朱凡研究所(法国)波尔卡博士、马特尔博士等国际共同研究小组， 以中子x射线小角散射为首的多个实验数据与计算机建模及模拟技术的综合解析方法，成功解析了时钟蛋白质在振动周期中形成的由24个分子构成的巨大复合体的全长结构和动力学，明确了这个巨大复合体控制昼夜节律的结构的一部分。

 本研究通过实验科学和计算科学的发展与整合，明确了x射线晶体结构分析和低温电子显微镜等现有结构生物学方法难以实现的含有波动的巨大蛋白质复合体的结构。 这种综合分析方法有望通过应用于同样的巨大复合体，为生命科学带来新的见解。 本成果将于2022年3月10日在线发表在英国国际学术杂志Communications Biology上。

1 .背景 人类体温、心率、激素分泌等与生理功能相关的现象有24小时周期。 众所周知，这种周期现象与日照时间和涨潮一样，与地球的自转周期相呼应，被称为昼夜节律，由生物钟控制。 蓝藻的生物钟仅由三种时钟蛋白KaiA、KaiB和KaiC控制，它们自主地以24小时为周期重复离散集合。 为了理解这种离散集合昼夜节律的表达机制，阐明时钟蛋白质形成的各种复合体的溶液结构很重要。 但是，在该周期中出现的由KaiA-KaiB-KaiC形成的巨大复合体( ABC复合体)，虽然通过低温电子显微镜解开了部分结构[注1]，但全长结构[注1] (包括被预测为运动性高的KaiA的n末端侧结构域[注1] )尚不清楚。在溶液中出现的该ABC复合体的全长结构的阐明中，存在以下三个课题。 课题1 :从凝聚体和解离成分共存的溶液中选择ABC复合体进行观测。 课题2 :为了阐明具有高运动性的KaiA的行为，应从复合体中选择KaiA进行观测。 课题3 :在解决课题1、2的基础上，开发巨大复合体的结构和动力学分析方法。 本研究小组致力于克服课题，阐明了包括ABC复合体动力学在内的全长结构。

2 .研究方法成果 在本研究中，为了解决课题1，使用与凝胶过滤色谱( SEC )的成分分离连结进行x射线中子小角散射( saxssans ) [注2]的最新方法——“sec-sax ssec-sans法”，对多成分溶液中的ABC复合体进行了分析 为了解决课题2，在SEC-SANS测定中采用了与使用氘代标签试样的反转对比度匹配( iCM )法[注3]相结合的“SEC-iCM-SANS法”，由ABC复合体中的12个KaiA的部分结构产生的散射普 并且，构建了新的计算分析法，成功地从散射轮廓得到了再现ABC复合体在溶液中的结构动力学的模型。 具体而言，建立了使KaiA在先前研究中尚未明确的ABC复合体中的配置发生各种变化的2000万个全长结构模型，从中筛选出再现上述散射轮廓的结构模型，并以该筛选出的模型为初始结构进行了分子动力学(MD )模拟[注4]，采用稳定的结构作为最佳模型(图1 (b ) )。

图1:(a ) sec-sax ssec-ICM-sans的示意图。 通过用SEC进行成分分离，可以选择测量特定的成分，消除了复合体分析中成为课题的多成分性。 ( b )使用计算机的分析流程图。 创建了具有可能的KaiA配置的所有结构，使用sec-sax ssec-ICM-sans进行了筛选，最后用MD评价了结构稳定性，采用了最佳结构。 本研究通过上述实验和计算科学的整合方法，明确了ABC复合体的全长结构及动力学。 特别是，明确了迄今为止没有捕捉到的KaiA的n末端侧的两个域(图2，红色和蓝色)的配置及其动力学是一大成果。 具体而言，如图2(c )所示，蓝色结构域位于复合体的最上层，以掩盖与KaiC可相互作用的界面的方式运动，表明阻碍了溶液中KaiC与该位置的结合。 本结果表明，Kai蛋白系统在ABC复合物形成时，通过KaiA的运动阻碍与溶液中的KaiC的不必要的相互作用，控制着解离缔合构成的昼夜节律。

 

図2：在ABC三方复合体上的立体构象。 KaiA是二聚体，每个单体有两个结构域。 在图中，一个KaiA的n端域和c端域分别用N1A (蓝)和C1A (水)表示，另一个KaiA的n端域用N2A (红)和c端域用C2A (紫)表示。 ( a )显示了KaiA2聚体上与KaiC的相互作用界面(黑虚线框)。 ( b )通过低温电子显微镜解开的ABC复合体的结构。 没有观测到KaiA2聚体的n末端结构域N1A (蓝)和N2A (红)。 因此，( a )所示的相互作用界面暴露在外部。 ( c ) ABC复合体的全长结构。 虽然连接NA和CA的环路用黑色表示，但特别是这次阐明的N1A和环路的配置，捕捉到了防止相互作用面暴露的情况。

3 .波及效果，今后的安排 即使使用结构生物学中最引人注目的方法低温电子显微镜，也很难弄清KaiA在溶液中运动性大的ABC复合体中的结构。 本研究通过组合最新的中子溶液散射法等多种实验方法获取所需的结构信息，并与计算科学方法集成，解决了这一困难。 阐明与生理环境相近的“溶液中”的结构和动力学对于理解生命现象是必不可少的，但本研究开始时列举的3个课题在很多生物超分子的结构分析中也同样出现。 因此，本研究确立的整合方法有望对今后结构生物学的发展做出巨大贡献。

4 .关于研究项目 本研究由京都大学复合原子能科学研究所、自然科学研究机构生命创建探究中心、该分子科学研究所、名古屋市立大学研究生院药学研究科、量子科学技术研究开发机构量子生命科学研究所、综合科学研究机构中子科学中心、立命馆大学、拉威朗朱凡研究所(法国)的国际共同研究实施。 另外，本研究基于京都大学研究合作基础新一代研究者支援、京都大学复合原子能科学研究所所内补助金、日本学术振兴会科学研究费补助金特别研究员奖励费( JP18J21063， JP19J15602 )、研究活动启动支持( JP20K22629 )、基础研究S(JP18H05229 )、该基金基础研究C(JP17K07361、JP17K07816、JP18K06101、JP19KK0071、 JP20K06579 )、国际共同研究强化B(JP19KK0071 )、年轻研究( JP19K16088，JP21K15051 )、文部科学省新学术领域研究( JP18H05534 )、在日本医疗研究开发机构创药等生命科学研究支援基础事业创药等尖端技术支援基础平台( BINDS ) ( JP20am0101106 )等的支援下进行的。

<用语解说> [注1] 结构域部分结构全长结构:蛋白质由氨基酸残基连接形成。 结构域是由几十到几百个氨基酸残基组成的蛋白质结构单元，KaiA由两个结构域形成。 蛋白质中一部分结构域的结构称为部分结构，蛋白质中所有结构域的结构称为全长结构。 [注2] x射线中子小角散射( saxssans ) :向试样溶液照射x射线中子，精密测量小角(约10°以下)下的散射强度。 可以从得到的散射强度的角度依赖性( =散射轮廓)中提取溶液中的分子大小和分子对称性等结构信息。 [注3] 反转对比度匹配( iCM )法:利用中子溶液散射中75%氘代的蛋白质在100%重水溶剂中散射可视化。 本研究通过氘代KaiB和KaiC可视化，成功提取了ABC复合物中KaiA的部分结构。 [注4] 分子动力学( MD )模拟:将关注的分子置于某力场中，通过求解牛顿方程，计算时间相关分子运动的方法。 近年来，随着超级计算机运算处理能力的提高，即使是ABC复合体这样的巨大蛋白质复合体也可以应用。

<研究者的评论> 小角散射与计算科学相结合，可以以立体构象复杂、具有较大波动的结构为特征。 我们认为，这种蛋白质的动力学对理解功能表达机制至关重要，不仅揭示了立体构象，而且展示了有助于结构生物学发展的研究成果。 (杉山正明) 

  <论文标题和作者> 标题: overall structure of fully assembled cyano bacterial kai ABC circadian clock complex by an integrated experimental-computational aproch(通过实验和计算科学整合方法阐明的蓝藻时钟蛋白KaiABC复合体全长结构)作者: 柚木康弘1，2，松本淳3，守岛健4，Anne Martel5，Lionel Porcar5，佐藤信浩4，与语理那1，2，6， 富永大辉7，井上伦太郎4，矢木真穗1，2，6，奥田绫4，清水将裕4，里出令子4，寺内一姬8， 河野秀俊3，*，矢木宏和1，*，加藤晃一1，2，6，*，杉山正明4，* 1名市大院药，2自然科学研究机构生命创建探究中心，3量子科学技术研究开发机构，4京大复合研，5 Institut Laue–Langevin，6自然科学研究机构分子科学研究所，7综合科学研究机构中子科学中心，8立命馆大生命科学，共同第一作者，*共同责任作者 刊登杂志: communication s biology doi:10.1038/s 42003-022-03143-z