【发表要点】 成功实现了亚皮秒(注1 ) ( 1皮秒为1兆分之一秒)的极短时间内发生的荧光蛋白质运动的可视化。 我们弄清楚了荧光蛋白质的光接收部一边扭曲一边结构变化的结构。 有望促进利用荧光蛋白质的超分辨显微镜的观察技术。
【概要】 光开关型荧光蛋白质是一种荧光蛋白质，当被特定的光照射时，荧光的开关会切换。 荧光蛋白质有接受光的被称为发色团的结构，荧光的开关与发色团的结构变化联动地发生。 但是，发色团在光照下结构会立即发生变化，因此很难捕捉到动作，开关机构的详细情况也不清楚。 东北大学多元物质科学研究所的南后惠理子教授(理化学研究所放射光科学研究中心组长)、藤原孝彰助教、帝国学院伦敦的Jasper J. van Thor教授等研究小组发现，300飞秒( 1飞秒为1， 成功观察了光开关型荧光蛋白rsEGFP2的原子在从000万亿分之一秒)到微秒( 1微秒为百万分之一秒)的极短时间内的运动，发现发色团的分子结构在扭曲的同时发生变化。 本研究成果在线刊登在2023年7月7日(当地时间)公布的美国化学会志journal of the American chemical society上。
【研究背景】 荧光蛋白质是吸收特定波长的光而发出荧光的蛋白质，作为2008年诺贝尔化学奖的获奖对象也受到了关注。 通过基因重组操作，使连接荧光蛋白质的蛋白质在细胞内表达，照射光后，可以在活细胞内直接观察蛋白质分子的位置和行为，生命现象的理解得到了飞跃性的提高。 这样的生物成像中利用的荧光蛋白质，到现在为止被设计了各种各样的类型，通过光的照射可以控制荧光性的开·关的光开关型荧光蛋白质也被开发出来了。 基于荧光蛋白质的光开关是由发色团的光引起的顺式反式异构化引起的。 这种异构化的方法有两种，一种是发色团分子绕一个结合轴旋转的one-bond-flip机制(注2 )，另一种是绕两个结合轴旋转并伴有扭曲的hula twist机制(注3 ) (图1(a ) )。 但是，发色团大多具有对称的分子结构，无法区分是哪种机制发生了结构变化，再加上光照射引起的发色团结构变化非常快，因此很难捕捉其运动。
【研究方法】 为了解开荧光蛋白结构变化过程中遗留的谜团，研究小组通过泵浦探针法(注4 )和串行飞秒晶体结构分析( SFX ) (注5 )方法相结合的实验，用缩时扫描的要领对蛋白质的运动进行了“分子动画” 研究小组首先为了区分两种开关机制，通过基因重组操作，在光开关型荧光蛋白rsEGFP2的发色团中引入了破坏对称性的取代基(图1(b ) )。 接着，制作了改变型rsEGFP2的结晶，利用有泵探针型SFX用实验装置的日本x射线自由电子激光( XFEL )设施SACLA进行了测量。 具体而言，通过用可见光照射晶体开始光异构化，经过300 fs、600 fs、900 fs、5 ps、100 ps、1 μs后照射了XFEL。 然后，根据在各时间收集到的实验数据，确定rsEGFP2的立体结构，按照时间经过的顺序排列，将结构变化捕捉为动画。
【研究成果】 比较光照射前后的结构，在照射光后经过100 ps〜1 μs的时刻观测到了发色团的结构变化(图2 )。 发色团的结构表明，rsEGFP2的光开关过程是通过hula twist机制进行的。 在更早经过600 fs〜900 fs的时候，可以捕捉到发色团的扭曲结构(图2 )。 该结果是第一个直接观察发色团分子结构一边扭曲一边变化的hula twist机制的例子。
【今后的展望】 通过视觉捕捉光开关型荧光蛋白质的结构变化，证实了尽管在30多年前被提出，但详细机制尚不清楚的hula twist机制。 通过本研究成果得到的结构信息是合理设计新荧光蛋白质的指导方针的重要知识，期待对使用荧光蛋白质的超分辨显微镜(注6 )技术和细胞功能的表达控制技术的发展做出贡献。 【谢辞】 本研究是日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业新学术领域研究“高速分子动画法在蛋白质非平衡状态结构分析和分子控制中的应用(领域代表:岩田想)”( JP19H05776 )、日本医疗研究开发机构( AMED ) 制药等生命科学研究支援基础事业制药等尖端技术支援基础平台( (BINDS )“制药等生命科学研究的相关结构分析平台的支援和高度化( SPring-8/SACLA中蛋白质立体结构分析的支援和高度化) (研究代表者 【论文信息】 标题: serial femtosecond crystallography reveals that photo activation in a fluorescent protein proceeds via the hula twist mechanism 作者: Alisia Fadini1，Christopher D.M. Hutchison1，Dmitry Morozov2，Jeffrey Chang3，Karim Maghlaoui1，Samuel Perrett1，fangjid Jeslyn C.X. Kho1、Matthew G. Romei5、Rhodri M. Morgan1、Christian M. Orr6、Violeta Cordon- Preciado1、Takaaki Fujiwara7 Tomoyuki Tanaka4、Takehiko Tosha4、Rie Tanaka4,8、8、Shigeki Owada4,9、9、Kensuke Tono4,9、9、Steven G. Boxer5、Gerrit Groenhof2 1 Department of Life Sciences，Faculty of Natural Sciences，Imperial College London，London，UK 2 nanoscience center and department of chemistry，University of Jyväskylä，Jyväskylä，Finland 3 Department of Physics，Stanford University，Stanford，CA 94305，USA 4 riken spring-8中心； 1- 1- 1 Kouto，Sayo，Sayo，Hyogo，679-5165，Japan 5 Department of Chemistry，Stanford University，Stanford，CA 94305，USA 6 Diamond Light Source Ltd，har well science & innovation campus，Didcot，UK 7 institute of multi disciplinary research for advanced materials，Tohoku University，2- 1- 1 Katahira，Aoba，Sendai，Miyagi，980 8 Department of Cell Biology，Graduate School of Medicine，Kyoto University，Yoshidakonoe，Sakyo，Kyoto，606-8501，Japan 9 Japan synchrotron radiation research institute，Sayo，Hyogo，Japan *Corresponding authors 刊登杂志: journal of the American chemical society DOI:10. 1021/jacs.3c02313
【参考図】
图1. (a )发色团结构变化的示意图，( b )导入了取代基的发色团的结构变化
图2 .从光照到各观测时间发色团的结构变化。 用光照射前(浅灰色)、中间状态(灰色)、结构变化后(黑色)表示发色团。 图中的氯原子表示从箭头(红色)的区域向箭头(浅蓝色)的区域移动，然后向箭头(蓝色)的区域移动。 各时间发色团的结构根据氯原子的位置等来决定。
用语说明】
注1 .亚皮秒:短于万亿分之一秒的时间。注2.one-bond-flip机制:作为荧光蛋白发色团结构变化的倡导机制之一。 通过以一处结合为轴的旋转使结构发生变化的机构。
注3.Hula twist机制:是作为荧光蛋白质发色团结构变化而被提倡的机制之一。 是通过以两个部位的结合为轴的旋转使结构发生变化的机构，分子在扭曲的同时发生变化。
注4 .泵浦探针法:时间分解测量方法之一。 利用被称为泵浦光和探测光的2种脉冲光源，追踪物质状态和性质变化过程的方法。 以下，在基于串行飞秒晶体结构分析的时间分解测量中，将x射线自由电子激光( XFEL )用作探测光。
注5 .串行飞秒晶体结构分析( SFX ) :一种通过从大量晶体中收集部分x射线衍射数据并将它们合并为一个完整的数据来确定蛋白质等分子结构的方法。
注6 .超分辨显微镜:以超过光学显微镜衍射极限的分辨率观察物质结构的光学方法。 使用可见光时，200 nm左右为衍射极限。
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