向褐藻递送核酸技术的建立 -开发非转基因且简便的褐藻改变方法-

2024年3月22日 理化研究所 京都大学 庆应义塾大学尖端生命科学研究所 向褐藻递送核酸技术的建立 -开发非转基因且简便的褐藻改变方法- 理化学研究所(理研)环境资源科学研究中心生物高分子研究小组组长沼田圭司(京都大学研究生院工学研究科教授、庆应义塾大学尖端生命科学研究所特任教授)、吉永直人基础科学特别研究员(庆应义塾大学尖端生命科学研究所特任助教)等共同研究小组， 通过在纳米粒子上搭载以褐藻粘膜层/细胞壁的多糖类和细胞膜上的硼酸输送体[1]为目标的苯基硼酸( PBA ) [2]配体[3]，成功地将核酸( siRNA[4] )高效地导入褐藻内。 本研究成果是通过非遗传基因重组暂时改变了褐藻的性质，可以期待对环境具有耐性的物种的制作和褐藻的生物学特性相关理解的促进等做出贡献。 包括裙带菜和海带等在内的褐藻是产业生态学上重要的物种，但是通过导入外来核酸来控制褐藻特性的方法几乎没有被确立。 此次，共同研究小组发现，利用模型褐藻——西奥德罗，在由细胞渗透性功能性肽[5]和siRNA组成的纳米粒子表面搭载PBA配体，纳米粒子可以有效地进入褐藻内。 使用这种方法，在褐藻细胞内，通过导入的siRNA成功抑制了目标蛋白质的表达。 本研究将刊登在科学杂志《JACS Au》在线版( 3月22日:日本时间3月22日)上。

利用搭载PBA配体的纳米粒子向褐藻高效导入核酸 背景 裙带菜和海带等褐藻是独立于陆地植物和动物的进化而来的，具有独特的代谢过程，可以产生有用物质和作为生物燃料利用。 而且，褐藻的固碳能力很出色，可以将大气中的二氧化碳作为“蓝碳[6]”封入海中，因此近年来受到了更多的关注。 另外，褐藻在沿岸环境中是其他生物物种的栖息地，因此在生态学上也发挥着重要的作用。 像这样，褐藻在实用和生态学上都是不可替代的生物种类。 但是，这几年的气候变化威胁到了其生态系统。 保护褐藻免受气候变化的影响，并充分利用褐藻是极其重要的课题。 因此，理解褐藻的基础特性是必要的。 为了弄清褐藻的基础特性，以转基因为代表的需要外来核酸和蛋白质的基因工程方法是不可缺少的。 但是，从外部向褐藻导入核酸和蛋白质的方法几乎没有被确立。 到目前为止，沼田团队的领队们开发了使用由功能性肽构成的纳米粒子向陆地植物导入核酸和蛋白质的方法(注1~3 )。 此次，共同研究小组的目标是设计与褐藻表面存在的多糖类和硼酸输送体相互作用的新核酸传递系统。 注1 ) 2018年7月20日新闻发布会《探索入侵多种植物的肽》 注2 ) 2019年1月22日新闻发布会《植物的结构脆弱性对肽的基因传递至关重要》 注3 ) 2022年2月23日新闻发布会《用喷雾器改变植物》 研究方法和成果 共同研究小组开发了在由细胞渗透性的功能性肽和siRNA构成的纳米粒子表面导入了PBA配体的新型纳米粒子。 开发的搭载PBA配体的纳米粒子被确认在海水中与多糖类相互作用。 进一步发现，通过该PBA和多糖类的相互作用，纳米粒子可以有效地透过多糖类丰富的粘膜层。 接着，我们调查了到达细胞膜表面的纳米粒子是否被硼酸转运体识别并进入细胞中。 由于硼酸转运体和PBA的相互作用随海水的氢离子指数( pH )而变化，我们在各种pH下测定了模型褐藻——西奥德罗的细胞摄取效率。 在硼酸转运体与PBA强烈相互作用的高pH环境(海水pH:7.8 )下，装载PBA配体的纳米粒子显示出了优异的掺入效率(图1A )。 此外，通过共焦显微镜[7]进行荧光观察后，确认了PBA配体搭载纳米粒子确实已进入褐藻内(图1B )。

图1 PBA配体提高肌钙蛋白摄取细胞的效率 答:装载PBA配体的纳米粒子中，pH越高，摄取效率越高，但不含PBA配体的纳米粒子在任何pH环境下摄取效率都没有变化。 B :通过搭载PBA配体的纳米粒子，确认了荧光色素结合的siRNA (绿色)向示波器内部的送达。 接下来，我们调查了传递的siRNA是否会引起RNA干扰[8]，抑制目标蛋白质的表达。 通过免疫荧光染色法[9]观察靶蛋白，结果表明，与未处理的相比，使用载有PBA配体的纳米粒子给药siRNA的示波器可抑制靶蛋白表达(图2A )。 并且，使用搭载了PBA配体的纳米粒子，给予以参与生长激素合成的蛋白质为目标的siRNA时，暂时成功地抑制了水螅的生长(图2B )。

图2通过搭载了PBA配体的纳米粒子传递的siRNA对示波器的性状改变 A:用荧光色素(绿色)对靶蛋白质进行染色时，观察到使用装载PBA配体的纳米粒子导入了siRNA的西奥德罗与未处理的相比靶蛋白质质量有所减少。 光栅尺为50μm。 B :用搭载PBA配体的纳米粒子导入以参与生长激素合成的蛋白质为目标的siRNA时，水螅的生长暂时受到抑制。 光栅尺为100μm。 这些结果表明，通过搭载PBA配体，可以在至今为止难以导入核酸的褐藻中进行非基因重组并暂时抑制基因表达。 今后的期待 在本研究中，通过在纳米粒子表面搭载PBA配体，成功地将核酸导入到了迄今为止难以传递的褐藻中。 这种不需要特别的机器，就可以高效且暂时地向褐藻导入核酸的方法，有望推进对至今为止停留的褐藻的基础理解，为褐藻的保护和活用做出贡献。 保护褐藻免受最近急剧的气候变化的影响，关系到整个沿岸环境乃至我们社会生活的可持续发展。 另外，装载PBA配体的纳米粒子不仅可以应用于siRNA，还可以应用于其他核酸和蛋白质的导入，因此可以用于制作新的育种等广泛的目的。 在联合国制定的17个“可持续发展目标( SDGs ) [10]”中，此次研究有望对“2 .零饥饿”、“13 .应对气候变化的具体对策”以及“14 .保护海洋的丰富性”等做出贡献。 补充说明 1 .硼酸转运体 具有使作为必需营养素的硼透过细胞内的能力的膜蛋白。 2 .苯基硼酸( PBA ) 已知与糖类等含羟基化合物可逆结合的合成分子。 3 .配体 通过与特定的生物分子结合而发挥生理作用的物质。 一般多指与受体结合的分泌因子(激素、生长因子等)。 4.siRNA 21~27个碱基对双链RNA。 通过使细胞摄取合成的siRNA，可以抑制具有互补序列的基因的表达。 siRNA是small interfering RNA的缩写。 5 .功能性肽 通过合理设计氨基酸序列，使其具有向细胞内运输物质所需的各种功能的肽。 例如，有透过细胞膜提高细胞摄取效率的细胞膜透过性肽等。 6 .蓝碳 来自二氧化碳的碳，通过海洋生物的作用，从大气中固定到海里。 海藻等蓝碳生态系统将吸收的二氧化碳作为有机碳储存在海底。 7 .共焦显微镜 指在观察像细胞一样有厚度的试样时，能够聚焦在特定位置进行观察的显微镜。 通过对来自细胞内的荧光进行大范围成像，可以观察细胞中发生的各种现象。 8.RNA干扰 与导入细胞内的RNA具有互补序列的信使RNA(mRNA )被分解，基因表达被抑制的现象。 由于导入细胞内的RNA在一定时间后会被分解，因此可以进行暂时性的基因表达控制。 9 .免疫荧光染色法 使用结合了荧光色素的抗体只检测样品中抗原的方法。 本研究中siRNA的靶蛋白为抗原。 10 .可持续发展目标( SDGs ) 2015年9月联合国峰会通过的《可持续发展2030议程》所载2016-2030年国际目标。 由实现可持续世界的17个终点、169个目标构成，不仅是发展中国家，发达国家自身也在努力实现通用(普遍)，日本也在积极地努力(从外务省主页进行了一部分变更后转载)。联合研究小组 理化研究所环境资源科学研究中心生物高分子研究小组 团队领导沼田圭司( numatakidage ) (京都大学研究生院工学研究科教授、庆应义塾大学尖端生命科学研究所特任教授) 基础科学特别研究员吉永直人 (庆应义塾大学尖端生命科学研究所特任助教) 研究员宫本昂明 技术人员(研究当时)后藤麻美 琉球大学理学部海洋自然学科 助教田中厚子 研究支援 本研究由科学技术振兴机构( JST )战略性创造研究推进事业总结实施型研究ERATO“沼田有机反应集群项目(研究总结:沼田圭司，JPMJER1602 )”、同创的工厂形成支援计划COI-NEXT“零碳二氮” JPMJPF2114 )”、文部科学省数据创造活用型材料研究开发项目“利用生物高分子大数据驱动创造完全循环型生物自适应材料(研究总结:沼田圭司、JPMXP1122714694 )”、 日本学术振兴会( JSPS )科学研究费资助事业特别研究员奖励费“开发可改变褐藻类基因的硼酸转运体靶向型创新核酸传递系统(研究代表者:吉永直人、22J00843 )”、理化学研究所奖励课题(研究代表者:吉永直人)、基础科学特别研究员研究费(研究代表者:研究代表) 原论文信息 Naoto Yoshinaga、Takaaki Miyamoto、Mami Goto、Atsuko Tanaka、and Keiji Numata、 " phenylboronic acid-functional ized micelles dual-targeting boron IC acid transporter and polysaccharides for SiRNA delivery into brown an an 主讲人 理化研究所 环境资源科学研究中心生物高分子研究小组 团队领导沼田圭司

(京都大学研究生院工学研究科教授、庆应义塾大学尖端生命科学研究所特任教授) 基础科学特别研究员吉永直人 (庆应义塾大学尖端生命科学研究所特任助教)

吉永直人 新闻发言人 理化研究所宣传室新闻发言人 京都大学涉外宣传科国际宣传室