发现植物的RNA诱导沉默复合体中存在能够与DNA强烈结合的群体~期待新的基因表达调控技术的创造~

2024年4月16日 立教大学 科学技术振兴机构

发现植物的RNA诱导沉默复合体中存在能够与DNA强烈结合的群体~期待新的基因表达调控技术的创造~立教大学(东京都丰岛区，总长:西原廉太)理学部的岩川弘宙副教授发现，在植物的RNA诱导沉默复合体(注1 )中存在能够与DNA强烈结合的群体。 研究成果的内容刊登在2024年4月16日(星期二) (日本时间)《Nucleic Acids Research》杂志上。

1 .发表要点 ◆研究表明，植物的RNA诱导沉默复合体( RISC )的3组分别具有不同的核酸结合特性。 ◆这表明，在3个组中的一个核内工作的RISC，不仅与RNA，还与DNA强烈结合，具有以前不知道的性质。 ◆期待与新的基因表达控制技术的开发相关联。2 .发布概述 在真核生物中，20-30个碱基左右的小分子RNA与一种叫做AGO的蛋白质形成RNA诱导沉默复合体( RISC )，通过与互补的RNA结合来调控靶基因的表达。 这个机制被称为RNA沉默，在生物的发生、分化、抗病毒反应等各种生物学过程中起着重要的作用。 植物编码多个AGO，根据氨基酸序列的同源性，将其分为3组。 到目前为止，虽然已经研究了属于各组的RISC的功能，但是这些RISC与什么样的核酸序列紧密结合还不清楚。 此次，立教大学理学系的岩川弘宙副教授表明，植物中3个组的RISC分别具有不同的核酸结合特性。 另外，研究表明，在细胞质中工作的两个小组与RNA紧密结合，而在细胞核内工作的小组以与RNA同等或更强的强度与DNA结合。这些发现在暗示存在“植物的RISC与DNA直接结合发挥作用”这一未知机制的同时，有望开发出新的基因表达控制工具。 本研究的成果是在科学技术振兴机构开创性的研究支援事业“植物RNAi的理解和应用:面向自由的人工基因组表达”(研究代表者:岩川弘宙)等的支持下得到的。

3 .发表内容 AGO是从原核生物到真核生物广泛保存的蛋白质，具有切断核酸( RNA和DNA的总称)的作用。 已知原核生物的AGO与小分子DNA和RNA形成复合体后，与互补的质粒(注2 )和噬菌体(注3 )的DNA结合，将其切断。 另一方面，我们人和植物等真核生物所具有的AGO，与小分子RNA形成被称为RNA诱导沉默复合体( RISC )的功能复合体，与互补的RNA结合。 RISC通过序列特异性RNA断裂、蛋白质合成抑制、转录抑制等，在真核生物的各种生物学过程中发挥重要作用，包括发生、形态形成、抗病毒反应等。

作为模型植物的拟南芥编码了10种AGO，根据氨基酸序列的同源性将其分为3组。 属于组1和组2的RISC主要在细胞质中工作，负责切断目标RNA和阻碍蛋白质合成。 属于组1的AGO1-RISC在植物的发生、分化和应激反应中起重要作用，而属于组2的AGO2-RISC参与抗病毒反应。 另一方面，已知属于组3的RISC通过在核内与合成过程中的RNA结合，具有促进附近DNA甲基化，平静作为具有转移能力的DNA的转座子和非自身基因的作用(图1 )。 这样，虽然对植物RISC功能的理解有了进展，但各RISC与什么样的核酸序列强烈结合至今仍不清楚。

这次，立教大学理学系的岩川弘宙副教授，阐明了拟南芥中属于3个组的RISC的核酸结合特性。 首先，利用植物的无细胞翻译系统(注4 )合成AGO蛋白，向其中加入小分子RNA，从而合成属于组1的AGO1-RISC、组2的AGO2-RISC、组3的AGO4-RISC、AGO6-RISC和AGO9-RISC。将纯化后的RISC与和小分子RNA完全互补(形成碱基对)、或者一部分序列错配(碱基对不)的单链RNA或DNA混合，通过被称为过滤器绑定分析(注5 )的生物化学方法，定量分析了结合亲和性(图2 )。 结果表明，与组1和2的RISC相比，组3的RISC具有即使在3′辅助区域(注6 )互补性低时也能结合(允许失配)的性质(图3 )。更有趣的是，研究表明，在细胞质中工作的组1和2的RISC与RNA结合更强，而在细胞核中工作的组3的RISC与DNA结合更强(图3 )。 这些结果表明，各组RISC发展了不同的靶结合特性，以发挥其固有的功能。 本研究不仅加深了对植物RNA沉默机制的理解，也暗示了“真核生物的RISC与DNA直接结合发挥作用”这一至今为止完全未知的机制的存在。 此外，这些知识有望成为应用植物RISC创造基因表达调控技术的基础。

4 .发表杂志 杂志名称: NucleicAcidsResearch (在线版) 论文标题: the clade-specifictargetrecognitionmechanismsofplantriscs 作者: Hiro-okiIwakawa DOI编号: 10.1093/nar/gkae257 5 .研究项目 本研究是科学技术振兴机构开创性的研究支援事业(研究代表者:岩川弘宙，课题编号: JPMJFR204O )，该战略性创造研究推进事业的先驱(研究代表者:岩川弘宙，课题编号: JPMJPR18K2 )，文部科学省科学研究费补助金年轻人研究a (研究代表者:岩川弘宙，课题编号: 16H06159 )、基础研究b (研究代表人:岩川弘宙，课题编号: 23H02412 )的支持下进行。 6 .有关研究内容的咨询处 立教大学理学系生命理学系 副教授岩川弘宙 TEL:[phone] E-mail:iwakawa[at]rikkyo.ac.jp < JST事业相关事宜> 科学技术振兴机构开创性研究推进部 东出学信 TEL:[phone] e-mail:souhatsu-inquiry [ at ] jst.go.jp

7 .术语解说 注1 ) RNA诱导沉默复合体( RISC ) 由单链小分子RNA和称为AGO的蛋白质组成的复合体。 通过与作为构成成分的小分子RNA和互补的RNA结合，具有特异性地抑制靶基因表达的作用。 注2 )质粒 存在于细菌或酵母细胞内，与染色体DNA不同，自我增殖的DNA分子的总称。 注3 )噬菌体 感染细菌和古细菌并复制的病毒的总称。 注4 )植物无细胞翻译系 在植物培养细胞的提取液中添加氨基酸和ATP等，在试管内进行翻译反应的实验系统。 通过加入制备的信使RNA，可以在试管内合成任意蛋白质。 因为使用了细胞提取液，所以翻译反应以外的生化反应也可以在试管内再现。 本研究将自制的烟草无细胞翻译系统用于AGO蛋白的合成和RISC的形成。 注5 )滤镜绑定分析 使用膜过滤器分析两个分子的结合亲和性的方法。 本研究分析了RISC与放射性标记核酸( RNA或DNA )的结合亲和力。 注6 ) 3 '辅助区: RISC内小分子RNA包括种子区(从小分子RNA的5 '末端数第2至7或8个核苷酸)、中央区(第9至12个核苷酸)、3 '辅助区(第13至16个核苷酸) 以往对动物RISC的研究表明，种子区与靶RNA的碱基配对是RISC与靶结合所必需的，3′辅助区与靶RNA的碱基配对有加强RISC与靶结合的作用。

8 .附件

图1 :属于各组的RISC的代表性功能。 组1的RISC (特别是AGO1-RISC )对植物的发生和形态形成等很重要。 组2的AGO2-RISC涉及抗病毒反应。 已知组3的RISC与转座子和非自身基因的平静有关。

图2 :实验方法。 在由植物培养细胞制作的无细胞翻译系统中合成AGO蛋白质，通过加入小分子RNA形成RISC。 然后，将与小分子RNA序列完全互补(碱基对形成)的核酸( DNA/RNA )，或者与小分子RNA之间存在各种不匹配的核酸和纯化RISC混合，用过滤绑定分析的方法进行了定量结合分析。

图3:(左)各组RISC与靶RNA (黑)及靶DNA (红)定量结合分析结果示例。 在组3中，发现RISC也与DNA结合，比例与RNA相同或更高。 与在(右上)细胞质中工作的组1和组2的RISC相比，在核内工作的组3的RISC具有允许3 '辅助区域失配的性质，在3 '辅助区域的一部分不互补(用黑实线凹陷图示)的情况下，也能够结合(图3 ) (右下)左图显示，组1和组2的RISC与RNA强结合，而组3的RISC与RNA同等或更强地结合在DNA上。

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