各位股东，大家早上好中午好下午好晚上好（遍布24个时区，就是这么彪悍），咱们又见面了。
咱们的小群突破200了，我很欣慰，总算没有打脸，让人说咱这都是僵尸粉。
不过有个小问题，那就还是要定向邀请了，各位可以往前翻一翻，文章里面有微信的二维码，可以加了再邀请各位。
建议各位股东加俺的时候透露下自己的一点身份信息，不然都不知道咋备注，就头疼了。
今天想谈谈一个技术，也是想“抢救”一下，如果真如文章所说那么优秀这个技术不应该被埋；如果没那么牛，那也应该被拿出来锤一锤，给其他研究人员避避坑。
先说好，咱们只从技术角度出发，进行探讨和逻辑推演。
如果实测数据跟逻辑推演不一致，以实测为准，talk is cheap，show me the data。
“奇葩“
在国内众多单细胞测序厂家里面，有一朵“奇葩“，而且是我们之前就已经介绍过的，那就是寻因生物。
说他奇葩是有原因的，当然这不是贬义。
奇葩之一：
没有技术引进，全凭自己一锤一镐，从底层构建自己的产品体系。
两位创始人李宗文博士和焦少灼，从哪方面看也算不得大咖（两位别打我），然而人家还就是把产品给弄出来了，你说气人不气人。
奇葩之二：
单细胞两大体系微孔法和微流控液滴法，我都要，我都有。
我们都知道，新格元是微孔法，华大智造是微流控液滴法。
作为一个初创公司，按理说选一个方向就得了，他不，他都要，还都做出了成品。
奇葩之三：
曾经江湖传闻，《基因江湖》要把所有国产品牌的单细胞测序公司拉出来遛遛，他寻因生物第一个报名，就是要试试自己斤两，一点都不惧。
你说你一个初创公司，还没大咖站台，哪来的信心？
哎，人家寻因就是不怕，我从心里是佩服的。
奇葩之四：
这就是今天咱们要聊的，人家弄个新技术不得藏着捂着一段时间，保持神秘感不是？
他不。
开发成了不依赖oligo-dT的全场转录组技术scFAST-seq后直接发了篇文章，技术路线全给抖出来了，也不怕写轮眼？
既然他都不怕，那么我们就来近距离的看看这个技术，到底行不行，能干什么。
问题的由来
拿先驱10X Genomics的流程来举例，其中一个核心就是通过poly-dT与mRNA的3'端A尾结合，然后通过逆转录、扩增、片段化等等形成文库，这个是大家都很熟悉的。
这不是重点，重点是并不是所有的RNA都有poly-A尾，也不是所有的mRNA都有poly-A尾。
比如说原核生物的mRNA、部分lncRNA等RNA，人家就是没有或者有很短的3' 端ploy-A尾。
这个问题的存在，其实限制了很多应用场景。
比如说原核生物的单细胞测序，基本上就是GG了；做lncRNA研究，不能说做一半吧，反正总觉得缺点什么。
那么，就没有技术来解决这个问题了么？
答案是有的，还不止一种。。
两条路线
既然知道了很多RNA是由于没有ploy-A尾而不能被捕获进而进行测序，那么显而易见的想法就是两个。
路线1：给它加上ploy-A
这里面的代表作就是去年发表于《nature biotechnology》上的VASA-seq。
通过对RNA进行片段化，末端修复给它加上poly-A尾，那么后续就很容易理解了，还是老一套就可以解决。
路线2：随机引物一波流
这条技术路线，我们应该非常熟悉，那就是M20（跃真生物）家的M20-seq。
直接在逆转录阶段引入随机引物，管你尾巴是啥，我全都要。
那么，这两种路线就是完美的么？
事实上为了能对细胞内的RNA加poly-A或者逆转录操作的同时还让来源于同一个细胞的RNA老实的待在同一个地方，VASA-seq采用多步油包水和微注射的方式对同一个液滴进行连续操作就必不可少了, 问题是这可怎么量产呢？
或者说，怎样能够稳定的完成整个实验流程呢？
至于M20，大家还记得前面这张图么？在悬液制备和RNA逆转录之间，M20增加了一步透化。
这是采用了对细胞固定透膜处理以保证RNA被交联在单细胞内，这种固定细胞的后果可能会带来一些副作用，除了会让操作繁琐和细胞损失严重导致细胞得率降低。
进一步推演，可能会由于固定细胞的RNA逆转录效率低，进而导致单细胞基因数检测灵敏度的降低。
其实，可以理解成一种变种的空间转录组操作，当然这里并没有看到M20的实测数据，所以暂时只能通过注3的总结了各种方法相对scRNA-seq的效率变化情况（当然人家是为了突出自家的STARmap）。
那么，就没有更优秀的解决方案么？
答案是肯定的，那就是寻因这次披露的半随机引物法scFAST-seq。
寻因的答案-scFAST-seq
通过实验对比，发现采用12N7K的引物设计，也就是12随机+7已知序列的引物，能够很好的对单细胞转录组进行刻画。
同时，通过使用blocker对mt-rRNA和rRNA进行block，减少了数据的浪费。
这样，几乎无需对原有的流程进行改造，就打造完成了独特的scFAST-seq单细胞全长测序解决方案。（大家有发现图中的错误了吗？Droplet generation 不是genaration）
在下游，也展示了基于scFAST-seq技术的进一步应用空间。
比如可以用巢式PCR对目标区域进行富集，也可以通过探针法对目标区域进行富集。
这样，可以对单细胞层次的SNV进行检测，也就意味着能够替代部分Mission Bio的应用场景了（Mission Bio：？？？）。
那么，这个scFAST-seq表现如何？
于普通的3’转录组方案相比，scFAST-seq从5’至3’基因覆盖度均一。
在管家基因检出类似的情况下，scFAST-seq的lncRNA检出量要明显高于10X和GEXSCOPE。
当然，这并不意外，毕竟另外两家都是基于poly-T的。
scFAST-seq的数据也能很好的与常规的单细胞测序数据拟合，可以看到在不同的细胞类型中，二者的拟合程度很高（就是图有点模糊）。
应用场景
如咱们刚才提到的，scFAST-Seq的应用场景除了涵盖常规单细胞测序，还有很多可以扩展的。
比如说在lncRNA、cirRNA、细胞分化、单细胞突变/融合研究等方面，有着广泛的应用前景。
很显然，scFAST-seq对于细胞分化的刻画更为准确，更进一步的，如果再结合空间生物学技术，能够更为精准的对肿瘤微环境进行深入的研究。
同样的，通过结合探针捕获或者巢式PCR，scFAST-seq还能够支持从单细胞层面对体细胞的突变、融合进行研究。
值得一提的是，这里的探针捕获是针对基因全序列的，和之前3’端转录组只能富集靠近3’端的序列来检测突变区别还是有点明显的。
这种设计的原因是非常明显的，谁规定突变只能是靠近3’端的呢？
最后
整体看下来，寻因的scFAST-seq是一种极具创新性的单细胞测序方法，应用场景远远不止文中提到的这一些。
但是有些奇怪的是，拥有如此强大潜力的scFAST-seq却没见着寻因在官网上公开，只发了个文章，这就有点想打他们市场部的屁股了。
另外，一项技术是否能够在市场上取得成功，一个重要的点就是你得把应用做成标杆，具有可复制性。
这一点10X Genomics是国内所有做单细胞的企业要学习的对象，应用文档整理好了，标杆文章发表了，这样大家才有可复制、可推广的路径，对吧？
压力又给到了他们家的产品经理，呃，希望别头秃。
另外，这里必须要说明的是，本文根据目前公开数据、资料进行的分析推演，不排除实测数据打脸的情况，欢迎讨论、拍砖，这才能进步嘛，对吧？
（完）
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注1：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35760914/注2：https://www.biorxiv.org/content/10.1101/2023.03.19.533382v1注3：https://www.science.org/doi/10.1126/science.aat5691
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