文献细读|诱导性多能干细胞和胚胎干细胞技术在男性不育中的应用

干细胞（Stem Cells，SCs）来源广泛，分化潜能高，是目前治疗不孕不育具有前景的治疗工具。近年来，为解决严重的生育问题，一些解决方案已被开发出来，包括：体细胞诱导生成多能性干细胞，干细胞在体外转导生成生殖细胞，以及病人定制的多能干细胞。

1.干细胞

干细胞通常指在个体的整个生命过程中具有多向分化、自我更新和增值能力的细胞，可分为胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)和成体干细胞（ASC）。ESCs来源于人类或小鼠囊胚的内细胞团，具有显著分化为所有胚层细胞和无限增殖的能力。ASC是指存在于一种终末分化组织中的未分化细胞，如脂肪干细胞、骨骼肌干细胞、表皮干细胞、神经干细胞、造血干细胞等。在特定信号和适当条件下，ASC可分化为具有特定功能和不同性质的体细胞。1994年，Brinster报道了利用精原干细胞移植(spermatogonial stem cell transplantation，SSCT)治疗男性不育。

2.男性不育和无精子症

男性不育问题包括无精子症、少精子症、弱精子症、重症畸形精子症等，其中无精子症分为非梗阻性无精子症(NOA)和梗阻性无精子症（OA），约60% 的无精子男性是NOA。NOA被认为是最严重的男性不育形式，为了有自己遗传基因的孩子，治疗NOA的唯一选择是睾丸精子提取术(TESE)和卵胞浆内单精子注射(ICSI)。然而，NOA男性使用这种方法的成功可能性有限，因为每个TESE周期的取精率约为56 %，ICSI后续的活产率约为41 %，导致NOA男性只有23 %的机会生育一个孩子。通过将体外增殖的功能性精原干细胞（spermatogonial stem cells，SSCs）进行自体移植，理论上可以恢复NOA患者生成精子的功能。在睾丸活检后，进行体外SSC增殖和随后的睾丸移植，使SSC归巢并产生成熟精子。如果这种方法成功，理论上会导致射精管中存在精子，从而使男性能自然生育。

3.ESCs

近年来，ESCs向生殖细胞分化的研究取得了重大进展。小鼠胚胎干细胞(mESCs)被证实具有在体外产生精子样细胞和原始生殖细胞( primordial germ cells,PGCs)的能力。许多研究已经使用小鼠ESC分化为拟胚体，并可以产生PGC样细胞。然而，ESCs的生产存在伦理问题，限制了ESCs的可利用来源。

4.iPSC

诱导多能干细胞（iPSC）是指通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为具有多向分化和增值能力的多能性干细胞。根据Hayashi等的研究，ESCs或iPSCs可分化为表皮样细胞。在小鼠模型中加入骨形态生成蛋白‐4培养，产生PGC样细胞，将其移植到缺乏内源性生殖细胞的新生睾丸中可形成功能性精子。当这些生殖细胞移植到不育动物的曲细精管中时，它们开始再生精子发生，并在ICSI的基础上用单倍体配子对卵母细胞进行受精。人工体外授精后，再选择有活力的胚胎即可进行胚胎移植。

根据生殖细胞诱导研究的最新成果，利用自体iPSCs诱导的生殖细胞联合ART的新形式有可能用于没有活性配子的患者。如果男性患者的iPSCs能够被诱导为可育的精子，就有可能利用生成的精子进行ICSI或IVF。即使诱导没有产生成熟的精子，通过将SSCs移植到患者的睾丸中亦可恢复体内的精子发生。类似方式可用于从iPSCs诱导出可育的卵母细胞。尽管许多不孕症患者已经通过辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）获得了很好的治疗，但目前的ART是在不育夫妇能够产生可育配子的前提下进行体外受精(IVF)、宫腔内人工授精或ICSI。

因此，自体iPSCs来源的生殖细胞可以满足因衰老或医疗原因无活性配子但想要有自己基因孩子的不育夫妇的需求。比如一个年轻时患癌的幸存者，现发现他不育，理论上能够利用自己的血液、皮肤或其他类型的体细胞产生精子和生育后代。

iPSC的应用(人类疾病模型、病人定制细胞治疗、药物筛选）

5.  iPSCs向生殖细胞的分化

条件培养基和共培养系统已被用于重现生殖细胞分化的性腺微环境。含有胚胎成纤维细胞和支持细胞的共培养增加了PSC向PGCs的分化。使用共培养系统可获得预期的结果，但生物或化学定义的因子更适合用于诱导，因为它们提高了细胞在临床应用中的安全性，并增加了分化过程的可重复性。因此，使用含有生长因子的培养基被认为是分化诱导的一种常见选择。

Eguizabal等通过将iPSC衍生的PGCs培养在bFGF、LIF、毛喉素和CYP26的抑制剂中，演示了单倍体细胞诱导。CYP26是一种P450酶，能够使全反式维甲酸失活。梅德拉诺、Ramathal、Nguyen、Simon和Reijo Pera 利用质粒诱导hiPSCs中DAZ和VASA过表达，提高了减数分裂细胞形成率。同时，将经BMP8b - BMP4 - SCF - EGF和添加LIF的培养基诱导的Blimp1‐Venus阳性生殖细胞移植到不育雄鼠体内，可从iPSCs 获得可育精子和活子代。

可以衍生成精原干细胞的细胞来源。（a）从捐赠的受精胚胎中获得分离的多能内团细胞，这些胚胎处于囊胚阶段，然后作为人类胚胎干细胞无限期地扩增培养。（b）通过使用胚胎转录因子（性别决定区Y框2，八聚体结合转录因子4，c-Myc和c-myc，Kruppel样因子4）的混合物进行转导，从患者的体细胞（如成纤维细胞）重新编程为iPSC。

多能干细胞的自发分化是上述研究的基础，但性腺微环境和信号分子能够强烈影响生殖细胞分化。因此，体外诱导多能干细胞向生殖细胞分化最关键的因素之一是正确的培养条件。最近，有多篇文献报道了利用iPSCs产生生殖细胞。补充BMP4可增强人类iPSCs向VASA-GFP阳性PGC样细胞的分化。此外，利用条件培养基对分化方法进行了改进，培养基成分为带有重组体的卵巢或睾丸细胞。

技术总结

取患者身体组织，利用iPSC技术体外诱导分化成精原细胞，在构建的性腺微环境中产生精子，最后利用人工授精等辅助生殖技术孕育出携带自己遗传基因的孩子。生殖细胞的形成是一个复杂的过程，尽管仍存在一些挑战，但通过使用这些方法来产生配子，生殖医学和生物学的未来可得到改善。

引用文献：Mahabadi JA, Sabzalipour H, Bafrani HH, Hayat SMG, Nikzad H. Application of induced pluripotent stem cell and embryonic stem cell technology to the study of male infertility. J Cell Physiol. 2018;1–9. https://doi.org/10.1002/jcp.26757