高分辨率熔解曲线分析技术（high resolution melting analysis, HRMA）简介

高分辨率熔解曲线分析技术（ High Resolution Melting analysis），简称 HRMA，是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型和SNP检测的新工具，可以迅速的检测出核酸片段中单碱基的突变。 HRMA技术因其速度快，操作简便，高通量，灵敏性特异性高，对样品无污染等优点而被迅速的应用在生命科学、医学、农学、畜牧业等领域的研究工作中。其中，主要的研究方向集中在： 1 、基因未知突变以及 SNP 的扫描； 2、已知突变及 SNP 的基因分型； 3、动植物、微生物等物种的物种鉴定以及品种鉴定； 4 、法医鉴定、亲子鉴定； 5 、HLA 的配型； 6 、甲基化的研究等。

一、HRM 技术的基本原理：

    HRMA 技术主要是基于核酸分子物理性质的不同。不同核酸分子的片段长短、 GC 含量、 GC 分布等是不同的，因此任何双链 DNA 分子在加热变性时都会有自己熔解曲线的形状和位置。 HRMA 技术的基本原理就是根据熔解曲线的不同来对样品来进行区分。

   以二倍体细胞为例，当纯和子样品通过 PCR 扩增，经过变性复性后，仍然是纯合子，如图一 A 。而杂合子 PCR 扩增完，经过变性复性后，样品中会形成部分的含有非沃森 - 克里克配对的双链分子存在。

　　　　　　　　　　

 

图一： A ：纯合子样品 　　　　　　　　　　　　　　　　　　B ：杂合子样品

    如图一 B 所示，杂合子样品扩增后，经变性复性，会有非配对碱基的形成，而纯合子样品没有。这样，杂合子样品相对纯合子样品来说，双链不够稳定，表现在解链温度上就会有微小的差别。如果采用高分辨率的仪器进行检测，并用专门的软件进行分析，微小的差别就会被检测出来，从而成功的筛选出纯合子与杂合子。

下图是杂合子样品熔解曲线的的示意图：

 

图二：杂合子样品的熔解曲线为四种不同双链的熔解曲线的叠加的结果。

    以二倍体细胞为例，杂合子扩增后通过变性复性会形成二种同源双链和两种异源双链的混合物，在熔解过程中四种链会形成一条独特的溶解曲线，从而与纯合子的熔解曲线区分出来。

   下图是采用 Lightscanner 仪器对纯合子，杂合子，双杂合样品的分析结果

  

 

    图三 . 采用 Lightscanner 系统对标准样品的分析。灰色的曲线代表的是纯合子样品，红色的曲线代表的是杂合子样品，蓝色的曲线代表的是双杂合样品，通过 Lightscanner 系统的分析，三种样品被明显的分为了三类，表现出了极高的灵敏性和准确性。

二、 HRMA 技术的必备条件：

HRMA 技术走向实践应用主要基于两种技术的改进 :

1、双链 DNA 嵌入型饱和荧光染料 LCGreen 的开发；

    采用饱和的荧光染料是进行 HRMA 分析的必备条件之一。 LCGreen 是饱和的荧光染料，与传统的荧光染料 Sybr Green 相比有如下优点： LCGreen 染料在 PCR 时可以以饱和的浓度加入，不会抑制 PCR 反应而Sybr Green 染料浓度过高会抑制 PCR 反应。在进行 HRMA 分析时，由于饱和染料占据了 DNA 双链上每一对碱基上的空位，所以在双链解链时，染料立即与双链脱离，使得荧光信号发生较大的变化，而非饱和染料常发生位置上的迁移，从而对荧光信号没有大的影响。图四 A 所示，饱和染料可以占据 DNA 双链的每个碱基对，非饱和染料只能与部分碱基对结合。当熔解发生的时候， DNA 双链首先会有局部双链发生解链。采用 LCGreen 染料时，染料立即从 DNA 双链上发生脱离，造好较大的荧光值的改变，而 Sybr Green 则发生位置上的迁移，对荧光值的改变不大。图四 B 则展示了采用饱和染料和不饱和染料对纯合子和杂合子样品分析时熔解曲线峰图的差异图，如图 B 所示，采用 LCGreen 染料时，纯合子与杂合子熔解曲线峰图有较大的差别，采用 SYBR Green 时则基本没有差异。

下图显示了饱和荧光染料 LCGreen 和非饱和荧光染料 Sybr Green 的区别

图四 A ：非饱和染料 Sybr Green 在 DNA 双链熔解时会发生位置的迁移，饱和染料 LCGreen 在 DNA 双链熔解时则直接从双链上脱落下来。

图四 B ，使用饱和染料 LC Green 得到的 DNA 双链熔解峰可以很明显的将杂合子给区分出来。

2、 拥有精确控温装置和高密度数据采集本领的仪器的产生以及专业化分析软件的开发。

    Idaho 公司根据 HRMA 的方法专门设计出的仪器拥有精确控温装置和高密度数据采集本领。 Lightscanner 仪器的升温速度每秒 0.1 度，每摄氏度可以采集 100 个数据点，可以密集的绘制出 DNA 分子的熔解曲线。专业化分析软件的开发使得收集到的数据可以准确而快速的被鉴定出来。

三、 HRMA 技术的流程图

    目前，研究突变以及 SNP 的研究方法主要有 DHPLC、SSCP、 DGCE 、 MS 、测序等， HRMA 技术的优点主要在于： 1、 快速、高通量 —LightScanner 5 到 10 分钟完成 96/384 孔板的 PCR 产物检测， 20000 个 SNP/ 天；2、准确、灵敏度高、特异性好 — 接近 100% 准确性、特异性（ <400bp ），准确性 96.4% 和特异性 99.1% （ 400~1kb ）； 3、重复性好 — 重复性接近 100% ； 4、费用低； 5、不会对样品带来污染 — 染料，探针在 PCR 前加入，不需要后续的分离纯化，实现了真正的闭管操作；6. 操作简便 —LightScanner 只需将 PCR 产物（ 96/384 孔板）放入仪器内检测即可； 6、 染料的加入不影响后续的测序工作。

图五为目前筛选突变的几种常用的方法的简单流程图的比较：

图五，进行突变扫描的几种常用方法的流程图比较

 

    通过对目前常用的几种筛查突变的方法的流程比较可以看出， HRMA 技术在 PCR 扩增后即可直接被用来对样品进行分析，不需要样品的分离纯化。因而可以降低分离纯化过程中所带来的样品污染的可能性，同时，也能大大减少工作量。