摘要：外植体表面消毒是植物组织培养中试验材料转为无菌状态的第一环节。目前常用的消毒剂氯化汞和次氯酸钠均有一定弊端，因此探索新型的植物外植体消毒方法非常重要。本研究以二氧化氯消毒剂为研究对象，调查其在禾谷类作物水稻种子、草本植物雪莲果和木本植物石榴外植体消毒上的应用潜力。结果表明，80.0—133.0 mg/L ClO2处理水稻种子消毒效果较好，出愈率超过90%且所诱导愈伤质量较好；28.6—33.3 mg/L二氧化氯处理雪莲果嫩叶后，愈伤组织诱导率接近80%，与0.1%HgCl处理结果相近。石榴的消毒试验中，25—400 mg/L二氧化氯处理后嫩叶均脱色褐化死亡，而0.1%HgCl处理组材料生长良好，但二氧化氯低于80%时，部分石榴材料被污染。二氧化氯作为一种环境友好的新型消毒剂，具有替代0.1%HgCl在某些植物外植体消毒上应用的潜力。
关键词：二氧化氯；组织培养；水稻；雪莲果；石榴
前言
在植物组织培养过程中，外植体消毒是材料从带菌环境转为无菌状态的关键步骤。目前植物组培中最常用的消毒剂为氯化汞和次氯酸钠。然而，汞为重金属元素，对环境和人体都有极大的负面影响，同时国家严禁汞消毒废液排入下水道，无害化处理操作繁琐；次氯酸钠消毒反应后产生三氯甲烷等致癌物和氯代酚等毒性物质，同样威胁着环境安全和人类健康。因此，探索安全、高效和环境友好的新型植物外植体表面消毒剂意义重大。
二氧化氯为一种强氧化剂，最早由英国化学家Humphrey Davey通过氯酸钾
水溶液和盐酸反应生成，对微生物细胞壁有较强的吸附穿透能力，能有效氧化细胞内含巯基的酶并抑制微生物蛋白合成来杀灭微生物。二氧化氯与有机物及无机物反应时均具有很强的选择性，不产生发散性有机卤化物（TOX）和具致癌作用的三卤甲烷（TMH）。因此，世界卫生组织（WHO）推荐二氧化氯为安全消毒物质中的A1级产品（张含松，2003）。关于二氧化氯在作饮用水消毒（代园园等，2011）、农业生产（郑宏海等，2000；王化鹏等，2003；高宝岩等，2008；张明月等，2012）、水产品加工（史建华等，2006）、果蔬保鲜（潘永贵，2003；张顺和和张超，2006）及食品工业（蔡慧农和汤凤霞，2003）等领域应用的研究较多。然而，目前二氧化氯应用于植物组织培养中外植体消毒的报道不多。
由于生长环境和材料本身差异，各种植物表面携带菌类和内生菌种类均不同，因此探索各自适合的消毒方法很有必要。本研究以二氧化氯消毒剂为研究对象，调查其在禾谷类作物水稻种子、草本植物雪莲果和木本植物石榴外植体消毒上的应用潜力，为探索新型植物组培消毒方法提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料
禾本科植物水稻种子由本研究组种植并保存；草本植物雪莲果幼茎嫩芽取自淮北师范大学南山博士工作站试验地；木本植物石榴幼茎嫩芽采自淮北师范大学校园。二氧化氯消毒剂由北京必洁仕环保新技术开发有限公司提供。氯化汞为武汉福德化工有限公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 二氧化氯消毒剂配制
将1片A剂药片溶于50ml无菌水，完全溶解后加入5ml B剂，立即盖好瓶盖，5分钟后再加无菌水至500ml，获得二氧化氯消毒剂原液（400mg/L）。将原液进行系列倍数稀释，配制不同浓度二氧化氯消毒剂（现配现用）。具体浓度如下：1倍（200.0 mg/L）、3倍（133.0 mg/L）、5倍（80.0 mg/L）、7倍（57.1 mg/L）、9倍（44.4 mg/L）、10倍（40.0 mg/L）、12倍（33.3 mg/L）、14倍（28.6 mg/L）、16倍（25.0 mg/L）。
1.2.2 实验材料的预处理
挑取饱满、无病斑、胚完整的水稻种子用于表面消毒实验；雪莲果和石榴嫩叶经流水冲洗30 min，无菌滤纸吸干表面水分后进行消毒实验。
1.2.3 外植体消毒方法
水稻种子于所试各浓度的二氧化氯溶液浸泡25 min（期间不时摇动），吸干表面水分后接种至愈伤诱导培养基NB（Duan 等, 2012），各培养皿接种20粒种子。雪莲果嫩叶经预处理后置于各浓度的二氧化氯溶液浸泡25 min（期间不时摇动），吸干表面水分后接种于愈伤诱导培养基（MS+2,4—D 2.0 mg/L +蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8）培养基，各培养瓶接种10个外植体。石榴嫩芽在经预处理后置于各浓度的二氧化氯溶液浸泡25 min（期间不时摇动），吸干表面水分后接种于愈伤诱导培养基（MS+NAA 0.5 mg/L+6—BA 1.0 mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8），各培养瓶接种10个外植体。上述各试验均设置以浸泡于0.1%氯化汞溶液6 min为对照组，无菌水冲洗5次后吸干水分，接种于相应培养基，接种数量与各试验组一致。各处理均重复3次。水稻种子置于30℃黑暗培养，雪莲果嫩叶和石榴嫩芽于22℃黑暗培养。每天观察染菌情况并及时移走染菌材料，培养10 d后统计污染外植体数并拍照，20 d后观察材料生长情况。
1.2.4 数据统计
污染率和死亡率计算按下式进行：
污染率=污染外植体数/接种外植体总数100%
死亡率=死亡外植体数/接种外植体总数100%
出愈率=出愈外植体数/接种外植体总数100%
所有数据均以3次平行实验的平均值±标准差（Mean±Sd）表示。方差分析采用Duncan’s 软件进行。
2 结果与分析
2.1 水稻种子消毒效果
在水稻组织培养中，以种子作为外植体诱导愈伤组织并进行再生培养是最常用的途径。因此探索水稻种子表面消毒的新方法尤为重要。本研究以水稻品种日本晴为试验材料(图1—A)，探讨不同浓度二氧化氯溶液在水稻种子消毒中的应用潜力。由表1可知，随着ClO2浓度逐步升高，种子污染率呈现降低趋势。当ClO2浓度高于80.0 mg/L时，污染率均低于10.0%。在ClO2浓度80.0—133.0 mg/L处理组中，种子出愈率均超过90%（92.3%—93.3%），表明该浓度范围较适合于水稻种子外植体表面消毒。同时，采用ClO2进行表面消毒的材料愈伤组织呈鲜黄色、质地松脆，适合于继代培养或外源基因转化（图1—B）。该试验结果表明，二氧化氯能用于水稻种子外植体消毒，且消毒处理不影响后期水稻组织培养，具有于氯化汞消毒相当的效果。
图1 试验所用水稻日本晴及所诱导的愈伤组织
注：A，用于试验日本晴种子；B，80.0 mg/L ClO2 消毒后于愈伤诱导培养基培养3周。
2.2 雪莲果嫩叶消毒效果
雪莲果原产于美洲，为当地印第安人的主要食物来源。其所含糖分主要低聚果糖（Lachman等，2003），为糖尿病患者提供了一适合的糖类物质。雪莲果为菊科多年生草本植物，在长日照条件下可开花，但不结籽粒，主要以块种进行无性繁殖。因此，雪莲果的组织培养多以嫩叶作为外植体进行表面消毒(图2—1)。由表2可知，在0.1% HgCl2对照组中， 未出现材料污染和死亡情况，出愈率为76.7%(图2—B)。当ClO2浓度为25.0 mg/L时，雪莲果嫩叶污染率为23.3%；而在高于该浓度的其他试验组中，外植体污染率均为0。但当ClO2浓度高于40.0 mg/L时，部分外植体死亡，且死亡率随着浓度增加呈现升高趋势。在二氧化氯浓度为28.6—33.3 mg/L时，出愈率达78.3%—80.0%(图2—C)。该研究结果表明，28.6—33.3 mg/L二氧化氯可代替氯化汞进行雪莲果外植体消毒，且不影响后续研究。
注：A，雪莲果嫩叶；B，0.1%氯化汞消毒嫩叶；C，33.3 mg/L 二氧化氯消毒嫩叶。
2.3 石榴嫩叶消毒效果
石榴为一种多年生灌木或乔木植物，内生真菌较多，研究中常以新生嫩芽为试验材料(图3—A)。0.1% HgCl2对照组外植体生长良好(图3—B)。所有参试浓度的ClO2溶液处理组中，石榴嫩芽或嫩叶，外植体材料均无法存活，色素渗入培养基，且ClO2浓度越高褐化越严重(图3—C)。
由表3可知，在高于80.0 mg/L ClO2浓度处理试验组中，所有材料均未被污染；当ClO2浓度低于57.1 mg/L时，实验材料出现污染的情况，且污染率随着ClO2浓度降低逐步增加。该试验结果表明，适合的二氧化氯浓度能较好的杀灭石榴嫩叶表面微生物，然而在所试验的25—400 mg/L二氧化氯处理组中，所有材料都因色素流失而死亡。表明二氧化氯不适合于石榴嫩叶的表面消毒，须探索其其他类型组织作为外植体。
3 讨论
植物组织培养中，造成材料污染的原因包括接种污染、培养过程污染和外植体自身携带微生物（蔡慧农和汤凤霞，2003；代园园等，2011），其中前两类都可改变操作和试验条件得以解决，而第三类则必须通过严格的外植体表面消毒加以控制。当前常用的外植体消毒剂氯化汞和次氯酸钠对环境和人体都有一定负面作用，因此探索新型的植物外植体消毒方法极为重要。
二氧化氯作为一种新型消毒剂，在反应后不会产生对环境和人体有害的物质，已广泛应用于自来水消毒和蔬菜保鲜等人类生产生活密切相关的领域（蔡慧农和汤凤霞，2003；代园园等，2011）。二氧化氯能有效杀灭微生物，推测其也能在植物外植体表面消毒中发挥作用。梁贤钾等（2003）曾探索过二氧化氯在小水榕外植体消毒中的应用，发现300 mg/L 二氧化氯处理30min能获得较好的无菌外植体。由于不同植物所携带微生物种类和数量均有差异，很有必要探索二氧化氯在不同类型的植物外植体表面消毒中的应用。本研究中，80.0—133.0 mg/L ClO2处理水稻种子消毒效果较好，出愈率超过90%且所诱导愈伤质量较好；28.6—33.3 mg/L二氧化氯处理雪莲果嫩叶后，愈伤组织诱导率接近80%，与0.1% HgCl处理结果相近。该结果表明，适合浓度的二氧化氯可代替氯化汞进行水稻种子和雪莲果嫩叶外植体消毒，且不影响后续研究。石榴的消毒试验中，25—400 mg/L二氧化氯处理后嫩叶均脱色褐化死亡，而0.1% HgCl处理组材料生长良好，这可能与石榴所富含的酚类物质有关。但二氧化氯低于80%时，部分石榴材料被污染，推测该试剂可能不适合于石榴的外植体消毒，或需采用其他外植体类型。
综上，二氧化氯作为一种环境友好的新型消毒剂，具有替代0.1%HgCl在某些植物外植体消毒上应用的潜力。
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
联系客服
