本发明属于发酵技术研究领域，具体涉及一种利用耐高温菌进行豆粕高温固态发酵的方法。
背景技术
豆粕是大豆经物理压榨或者溶剂浸提后的副产物，它作为一种重要的蛋白资源，目前一般将其直接添加到饲料中作为动物饲料来使用。但是这种饲料添加方法比较粗放，并且其中的豆粕蛋白在油脂加工中热变性严重，造成动物的吸收利用率不高，同时豆粕中的一些抗营养因子如胰蛋白酶抑制因子等，还会对动物的生长产生抑制甚至导致伤害，因此如何提高豆粕蛋白的利用率一直是学者们的研究热点。
目前常用酸、碱或酶水解法对豆粕进行处理，而酶水解法由于其操作简便、能耗较少等优点备受关注。该法利用蛋白酶在最适温度和ph值的酶解条件下，将大分子蛋白酶解为小分子多肽甚至氨基酸，从而提高豆粕品质。然而，酶解过程需要碱性环境来维持碱性蛋白酶活力，这就引发酶解结束后碱液如何进行处理的棘手问题，它会增加大规模生产时污水处理成本，限制工业化应用。这就需要寻求提高豆粕蛋白品质的其他方式。
生物发酵技术作为提高油脂饼粕蛋白品质的有效手段被研究的越来越广泛，它是利用微生物将豆粕原料中大分子蛋白和抗原蛋白分解为能够易于动物消化吸收的小分子功能多肽和其他活性物质等，减小甚至消除抗营养因子对动物生长的危害。同时还可以把豆粕中真蛋白甚至无机氮源转化为菌体蛋白，使蛋白总量增加，一方面解决饼粕蛋白资源稀缺问题，另一方面可以提升原料蛋白品质。
传统微生物固态发酵技术，需要在接种前通过高温对原料进行粉碎与灭菌处理，但工业化生产时由于处理量较大，能耗必然成为了一个突出问题，并且大型固体发酵设备染菌后灭菌的难度也很大。
嗜热脂肪芽孢杆菌是一种指示微生物，最初是用来对消毒设备杀菌效果进行评价。其最佳生长温度55～60℃，需氧或兼性厌氧，利用葡萄糖产酸不产气，它所产芽孢无致病性、无热源、无毒。目前其应用局限在环境污染物毒性评价、生物指示菌，以及获取热稳定性酶类等。而国内外对于在固态发酵豆粕领域使用这株菌的报道十分罕见，奥地利学者marinasmerilli等(directfermentationofpotatostarchandpotatoresiduestolacticacidbygeobacillusstearothermophilusundernon-sterileconditions,smerilli,2015)报道了利用该菌株对马铃薯淀粉和马铃薯渣进行固态发酵的研究，认为在60℃左右高温下不灭菌发酵染菌的风险很小。而国内研究大都集中在污水处理(一种生活污水处理工艺，吴晓丽，cn201810070073.6)、有机肥料发酵制备(一种发酵充分的有机肥的制备方法，杨诚，cn201810005305.x)等。尽管也有部分研究者进行了生物饲料的开发，但是发酵温度在20～25℃(棕榈生物饲料添加剂、制备方法及含该添加剂的生物饲料，闫慧生，cn201711262757.8)以及42～44℃(一种泌乳期奶山羊专用饲料及其制备方法和应用，董玉坤，cn201710528274.1)左右，并没有达到能够抑制原料杂菌生长的温度，因此在生产过程中如果不对原料灭菌，发酵过程依然有较高染菌的风险。
技术实现要素：
本发明为了解决现有固态发酵过程耗能较高的问题，提供了一种利用耐高温菌对豆粕进行高温固态发酵产多肽生物饲料的方法。以嗜热脂肪芽孢杆菌为发酵菌株，以未经粉碎、未灭菌的豆粕为发酵底物，绕开原料发酵前粉碎与灭菌步骤，突破工业化生产时原料粉碎与灭菌需大量耗能的技术瓶颈，在实现大规模生产的同时大幅度节约生产成本。采用高温固态发酵法，在抑制其他杂菌微生物生长的同时，完成豆粕高温固态发酵过程，以多肽含量为指标对固态发酵条件进行优化，并对发酵产品进行品质评价。
本发明的技术方案是：一种利用耐高温菌进行豆粕高温固态发酵的方法，包括以下步骤：将嗜热脂肪芽孢杆菌进行菌种活化，活化后菌株接入液体培养基进行扩大培养，将扩大培养的菌液接入事先与蒸馏水按一定比例混合好的豆粕培养基中，在一定的条件下进行豆粕高温固态发酵，所述高温固态发酵的发酵温度为45～65℃、时间0～96h、接种量5％～25％、料水比1:0.75～1:1.75、湿度为50％～90％。
优选地，所述菌种活化的温度为55～60℃、活化时间24～48h、摇床转速为180～200rpm。
优选地，所述高温固态发酵的发酵温度为55℃。
优选地，所述高温固态发酵的时间为48h。
优选地，所述高温固态发酵的接种量15％。
优选地，所述高温固态发酵的料水比1:1.25。
优选地，所述高温固态发酵的湿度为70％。
优选地，所述耐高温菌为嗜热脂肪芽孢杆菌。
优选地，所述豆粕培养基中豆粕不需要预先粉碎，也不需要进行灭菌。
优选地，豆粕高温固态发酵后的发酵产物通过65～70℃烘干后粉碎，以发酵物多肽含量为指标对高温发酵固态过程中的发酵条件进行优化。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明将耐高温菌例如嗜热脂肪芽孢杆菌引入固态发酵豆粕产多肽生物饲料的研究中，提高固态发酵温度至55℃，抑制杂菌生长，不仅可以略去原料灭菌步骤，还能简化工业操作流程，为发酵豆粕规模化生产提供理论基础。而且在高温下微生物生长代谢速度加快，豆粕固态发酵时间缩短，降低了多肽生物饲料的生产周期。最终发酵豆粕产品经干燥后的水分含量低、颗粒松散不结块，易于长时间存放。此外，目前尚未见利用耐高温菌例如嗜热脂肪芽孢杆菌以豆粕为主发酵原料进行高温固态发酵的报道。
附图说明
图1发酵温度对产物多肽含量的影响；
图2发酵时间对产物多肽含量的影响；
图3发酵接种量对产物多肽含量的影响；
图4发酵料水比对产物多肽含量的影响；
图5发酵湿度对产物多肽含量的影响；
图6发酵豆粕中嗜热脂肪芽孢杆菌与土著杂菌的拮抗作用；
表1粉碎与不粉碎豆粕在多肽含量上的差异。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围并不限于此。
本实施例使用嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillusstearothermophilus)为发酵菌株，购置于中国工业微生物菌种保藏管理中心cicc，编号atcc7953。
一种利用耐高温菌进行豆粕高温固态发酵的方法，包括以下步骤：
将嗜热脂肪芽孢杆菌划线接入斜面培养基进行菌种活化，斜面培养基包括氯化钠4～6g/l、大豆蛋白胨4～6g/l、胰蛋白胨15～20g/l、琼脂15～20g/l，所述菌种活化温度为55～60℃、活化时间24～48h、摇床转速为180～200rpm。活化后菌株接入液体培养基进行扩培，液体培养基包括氯化钠3～5g/l、大豆蛋白胨3～5g/l、胰蛋白胨13～18g/l；将扩大培养的菌液按一定接种量接入事先与蒸馏水按一定比例混合好的豆粕培养基中，在一定的条件下进行豆粕高温固态发酵。
豆粕培养基中豆粕不需要预先粉碎，也不需要进行灭菌。
所述高温固态发酵的发酵温度为45～65℃、时间0～96h、接种量5％～25％、料水比1:0.75～1:1.75、湿度为50％～90％。
发酵产物通过65～70℃烘干后粉碎，以发酵物多肽含量为指标对高温发酵固态过程中的发酵条件进行优化。
发酵物多肽提取与含量计算方法为：准确称取5.0000g原料与发酵豆粕，加入100ml蒸馏水定容后，在室温下磁力搅拌提取30min，随后混合物4000×g离心10min。取全部上清液加入等体积10％(w/v)的三氯乙酸tca溶液，充分混匀后10000×g离心10min，取上清液并转移至50ml容量瓶中定容，用福林酚法测定上清液多肽含量。
实施例1
本实施例说明发酵温度对高温发酵豆粕多肽含量的影响，固定发酵时间48h，接种量10％，料水比1:1，湿度60％，发酵温度选取45℃、50℃、55℃、60℃和65℃，结果见图1。多肽含量在45℃、50℃、55℃、60℃和65℃温度下分别为49.16mg/g、52.58mg/g、58.99mg/g、55.33mg/g和52.59mg/g。因此发酵温度应选择55℃，这也是该菌株的最适生长温度。
实施例2
本实施例说明发酵时间对高温发酵豆粕多肽含量的影响，固定发酵温度55℃，接种量10％，料水比1:1，湿度60％，发酵时间选取0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h，结果见图2。发酵0h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h和96h时，多肽含量分别为21.74mg/g、29.16mg/g、53.53mg/g、58.01mg/g、62.75mg/g、63.30mg/g、61.23mg/g、65.43mg/g和65.80mg/g。考虑48h后多肽含量的变化无显著性差异以及发酵能耗与时间成本，故选择发酵时间为48h。
实施例3
本实施例说明发酵接种量对高温发酵豆粕多肽含量的影响，固定发酵温度55℃，发酵时间48h，料水比1:1，湿度60％，发酵接种量选取5％、10％、15％、20％和25％，结果见图3。在5％、10％、15％、20％和25％各个接种量下，多肽含量分别为50.30mg/g、52.15mg/g、57.21mg/g、56.42mg/g和55.33mg/g，故选择15％为发酵接种量。
实施例4
本实施例说明发酵料水比对高温发酵豆粕多肽含量的影响，固定发酵温度55℃，发酵时间48h，接种量15％，湿度60％，发酵料水比选取1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5和1:1.75，结果见图4。不同料水比：1:0.75、1:1、1:1.25、1:1.5和1:1.75进行发酵，产物多肽含量分别为53.28mg/g、55.70mg/g、62.33mg/g、60.70mg/g和58.99mg/g，料水比1:1.25时发酵产物多肽含量达到最高，因此发酵料水比选择1:1.25。
实施例5
本实施例说明发酵湿度对高温发酵豆粕多肽含量的影响，固定发酵温度55℃，发酵时间48h，接种量15％，发酵料水比1:1.25，湿度选取50％、60％、70％、80％和90％，结果见图5。在湿度50％、60％、70％、80％和90％下，产物多肽含量分别为58.24mg/g、59.08mg/g、62.03mg/g、61.07mg/g和59.51mg/g。由于70％与80％湿度下发酵多肽产量无显著性差异，故选择70％湿度进行发酵。
实施例6
本实施例说明在最佳发酵条件下的多肽和蛋白产量与原料的对比。在发酵温度55℃、时间48h、接种量15％、料水比1:1.25和湿度70％的条件下进行发酵，豆粕多肽含量可由原料中的27.14mg/g上升到62.75mg/g，粗蛋白由48.48％提高至51.00％。说明利用高温菌成功进行了豆粕高温发酵，提高了发酵产物多肽与蛋白含量，豆粕原料蛋白品质提升明显。
实施例7
粉碎与不粉碎豆粕在豆粕多肽含量上的差异对比。在发酵温度55℃、时间48h、接种量15％、料水比1:1.25和湿度70％的条件下进行发酵，豆粕分别在粉碎与不粉碎的条件下进行高温发酵，所得多肽含量差异如表1所示。结果显示，粉碎或不粉碎对豆粕原料以及高温发酵豆粕中多肽含量的影响不显著，说明在达到相同多肽含量的情况下，豆粕的粉碎步骤可以省略。
表1
实施例8
发酵豆粕中嗜热脂肪芽孢杆菌与土著杂菌产生拮抗作用。在发酵温度55℃、时间48h、接种量15％、料水比1:1.25和湿度70％的条件下进行发酵，对发酵后的豆粕用无菌水稀释至一定的稀释度，采用平板涂布法进行实验，结果如图6所示。光滑且保持完整圆形的是嗜热脂肪芽孢杆菌，白色且周边绒毛状的是土著杂菌，图中可以清晰看出，嗜热脂肪芽孢杆菌对杂菌具有一定的抑制作用，表现在杂菌边缘受到嗜热菌侵蚀，完整性再到破坏，特别是中间图下部，三株嗜热菌几乎将半株杂菌消灭。
上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。
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