视网膜色素变性治疗进展

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【摘要】 视网膜色素变性 ( retinitis pigmentosa, RP)是一组以光感受器细胞进行性变性为特征，具有高度遗传异质性的致盲眼病，是20~64岁年龄段人群遗传学致盲的首位原因，目前尚无有效的方法能阻止或逆转此病的进程。近年来随着分子生物学的发展，对RP分子发病机制认识不断深入，RP的基因治疗取得了初步成功， Leber’s 先天性黑懵的基因治疗取得很好的临床效果；针对不同发病环节的抗凋亡、神经保护等多种治疗手段被尝试，目前有多项针对RP治疗的临床实验研究已经或正在开展；而以胚胎干细胞、骨髓干细胞、视网膜干细胞等干细胞为基础的移植治疗和各种类型视觉假体植入则为晚期患者带来了希望。本文就此进展加以综述。天津医科大学眼科医院眼科孙靖

【关键词】 视网膜色素变性；基因治疗；细胞移植；神经保护 

 

视网膜色素变性 ( retinitis pigmentosa, RP)是20~64岁年龄段人群遗传学致盲的首位原因^[1]。目前尚无有效的方法能阻止或逆转此病的进展，电子助视器是唯一可以改善部分患者视功能的方法。近年来随着分子生物学的发展，对RP分子发病机制研究不断深入，多种针对不同发病环节的治疗策略被尝试。目前，共有44项针对RP治疗的临床实验研究已经或正在开展^[2]。

一、基因治疗

1. RP遗传学研究概况

绝大多数RP是单基因遗传，只有极少数是线粒体遗传、双基因遗传。据报道，有15~20%RP为常染色体显性遗传( autosomal dominant retinitis pigmentosa, adRP)，20~30%为常染色体隐性遗传( autosomal recessive retinitis pigmentosa, arRP)，6~10%是X染色体连锁遗传( X-linked retinitis pigmentosa, xlRP)。有几乎一半的散发性病例没有任何视网膜变性的家族史^[3]。自Dryja^[4]于1990年首次报道RP致病基因-视紫红质基因（rhodopsin, RHO）以来，到目前为止已定位了56个与RP有关的致病基因，其中32、20、6个基因分别与arRP、adRP、xlRP相关，其中49个已被克隆（http://www.sph.uth.tmc.edu），多个RP基因被发现和克隆是RP基因治疗的前提。RP在基因型和表型具有较大异质性，即不同位点的突变表现为相似临床表型，而同一位点基因突变在不同家系或同一家系内呈不同临床表型，或同一基因中的不同突变导致不同的临床表型。这使得RP在分子水平的潜在发病机制相当复杂，大大增加了RP分子发病机制诊断的难度。

2. RP基因治疗

对于单基因遗传病，基因治疗的策略是通过插入正常基因来代替突变的基因或封闭突变基因的表达。arRP是由于基因突变引起了野生型基因产物的生成减少，从而导致功能丧失，可以通过载体介导正常基因代替缺陷基因，恢复正常蛋白的分泌。而adRP则是正常与异常基因产物被分别表达，异常基因产物在光感受器细胞内的不断积累，最终导致细胞变性死亡。因此正常基因的导入并不能达到治疗的目的，而应该进行基因灭活。目前常用的方法是通过小干扰RNA、反义技术或核酶治疗来封闭异常基因表达^[5-6]。adRP基因治疗的最大困难在于基因突变的异质性，如常见致病基因RHO就有200多种突变。O’Reilly等报道，小干扰RNA基因沉默联合基因替代治疗可能是解决此问题的途径，对adRP动物模型治疗显示了一定效果^[7-8]。

目前用重组腺病毒（recombinant adeno-virus, rAV）、重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV)、慢病毒以及DNA微球体等为载体的基因替代治疗在多个arRP动物模型上取得了成功^[9-11]。研究表明在arRP早期行基因替代治疗，能改善视网膜结构，提高光感受器细胞的功能，恢复ERG反应，延缓疾病的发展。最成功的基因替代治疗是色素上皮细胞特异基因（retinal pigment epithelium-specific gene 65, RPE65）突变引起的Leber’s 先天性黑懵（Leber’s congenital amaurosis，LCA）。LCA的动物模型瑞典Briard狗视网膜下注射rAAV介导的人RPE65 cDNA，注射后2周即出现治疗反应，瞳孔对光反应增加、眼球震颤减轻；5周时ERG出现反应，3个月达到高峰后逐渐下降，术后3年ERG波幅仍明显大于对照眼^[12]。最近针对RPE65基因替代治疗的一期临床实验已经在三个大的医学中心展开（穆尔菲尔兹眼科医院，费城儿童医院，宾夕法尼亚和弗罗里达大学）前期预实验目的是验证载体的安全性，参加实验的9个病人随访3个月的结果表明rAAV载体安全，治疗眼注射局部视网膜光敏度增加，患者瞳孔对光反应、视野有不同程度改善^[13-15]。更重要的是三个治疗组没有任何患者出现严重眼内炎症反应。最近Cideciyan等^[16]报道了3例患者随访1年的结果表明，全身体检正常，血尿检查未见异常，体液中靶向AAV2衣壳抗体滴度低于人群平均水平。视力，光敏度以及光适应等眼部检查与术后3个月结果一致，电生理检查结果与RPE-65变性狗的长期结果一致。作者认为，随着RPE65基因替代治疗的结果相继发表，通过对患者病情、注射部位、载体剂量和体积，基因型和术后结果的分析，能进一步优化我们的治疗策略。以上结果表明，RP基因治疗是可行，有效的，但病毒载体的长期安全性以及治疗的长期有效性尚需进一步的观察。

二、细胞移植

细胞移植是基于用正常细胞代替受到破坏的光感受器细胞，重建神经联系，以恢复视功能的设想。在研究早期，移植细胞来源于胚胎或初生期发育的视网膜，含有视网膜前体细胞、分化的神经元和光感受器细胞，以完整视网膜片或分成小片植入视网膜下腔，视网膜片存活、分化，但容易形成“玫瑰花结”，细胞移行和融合困难，很难与宿主的神经元产生功能上的联系，所以视力改善不是很明显^[17]。用酶消化发育的视网膜成细胞悬液后移植，细胞融合增加^[18]。MacLaren^[19]等报道，移植不同年龄的视网膜细胞悬液到成年或变性小鼠视网膜，如果移植供体视网膜处于视杆细胞生成的高峰阶段，则移植细胞会移行到外核层，形成光感受器细胞，与外丛状层宿主双极细胞建立突触连接，改善视功能。融合成功与否与供体的年龄有关，而与宿主年龄无关。因为来自胚胎或初生期的视网膜组织有限，而且临床应用存在伦理道德问题，同种异体移植有免疫排斥的风险，因此目前研究的细胞来源转向干细胞。

干细胞是一类能在体外持续繁殖的一类细胞，为治疗提供了充足的来源。有报道将来自海马的神经前体细胞经玻璃体腔注射入新生或成年视网膜变性大鼠眼内，移植细胞不同程度移行进入视网膜各层，形态上类似视网膜神经元，但不能分化成光感受器细胞，也不能表达视紫质和外周蛋白^[20-21]。也有研究报道，成年哺乳动物的虹膜和睫状体上皮的色素细胞可以形成神经球，其子代细胞能分化成表达神经元蛋白和形态上类似神经元的细胞，可能是潜在的视网膜干细胞的来源^[22-23]。Coles等^[24]把来自人睫状体色素细胞的神经球注射入新生鼠眼内，部分细胞进入视网膜下腔与外核层融合并表达视杆细胞外节蛋白Rom1，但部分细胞仍保持色素上皮特点，表达人特异性色素上皮标志物bestrophin。目前有关视网膜干细胞能否分化为光感受器细胞用于RP治疗的报道不一，需进一步研究^[25-26]。

目前最有前景的细胞来源是胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESCs）和间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)。ESCs来源于受精胚泡的内细胞团，处于未分化状态，具有持续增殖能力。在特异性组织环境中，能分化成特定类型的细胞，但也可以形成畸胎瘤。研究表明，人ESCs体外诱导可以分化成光感受器细胞、双极细胞、视网膜色素上皮细胞等视网膜细胞，将体外诱导的光感受器细胞移植入视网膜变性小鼠视网膜下腔，可恢复小鼠的感光功能。但ESCs应用最大问题在于如何控制肿瘤的发生，以及伦理和排斥反应问题^[27-29]。而由成人体细胞引入ESCs转录因子而成的诱导性多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），则不涉及伦理和排斥反应问题，成为细胞移植的新来源。最近研究表明，iPSCs能体外诱导生成形态上类似人光感受器细胞和视网膜色素上皮的细胞，并能表达光感受器细胞和色素上皮细胞特异蛋白，分化的视网膜色素上皮细胞在体内和体外都显示有吞噬光感受器的能力，但iPSCs应用也面临成瘤性的问题^[30-31]。

MSCs是来自基质而不是血液的、具有多向分化潜能的细胞，骨髓是最常见的来源。Tomita等报道，用钩针机械损伤成年大鼠视网膜，注射MSCs到大鼠玻璃体腔，MSCs能分化成视网膜神经细胞^[32]。最近Wang等报道，经鼠尾静脉注射MSCs，能明显延缓Royal College Surgeons (RCS)大鼠光感受器细胞的变性死亡，血管渗漏和异常血管减少，视网膜CNTF、bFGF、BDNF表达增加^[33]。MSCs治疗RP的一期临床结果显示，RP患者视力、颜色分辨能力增加，畏光减轻。考虑到MSCs的同源性，容易分离和没有伦理问题，因此其应用前景比较可观^[34]。

三、神经保护治疗

1.        神经营养因子

视网膜细胞移植的成功使人想到可能是某些可扩散因子促进了光感受器细胞存活，这些因子即神经营养因子，它是一类能促进神经元存活、生长、分化．并维持其功能的细胞因子，它们的缺乏会加速光感受器细胞的变性死亡。用于RP研究的因子主要包括睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor, CNTF）、脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor, BDNF）、成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）、胶质源性神经营养因子(glial-derived neurotrophic factor, GDNF)等，其疗效已在多种RP动物模型中得到验证^[35-37]。但神经营养因子的半衰期较短，只能局部使用，多次玻璃体腔注射会引起许多并发症，因此治疗的关键在于选择有效的给药途径。CNTF基因修饰的人视网膜色素上皮细胞系（ARPE-19）通过细胞微囊技术植入RP患者眼内，6个月后取出微囊进行检测表明有大量活细胞分泌CNTF，参加实验的10个患者中有3眼术前视力低于20/800，研究期间视力未见下降；7眼视力提高，其中3眼提高10~15个字母，相当于Snellen视力表提高2~3行 ^[38]。这项研究结果表明，以病毒为载体的转基因治疗和细胞包囊技术联合基因工程技术是目前最有效的方法。

2. 杆细胞来源视锥细胞活性因子（Rod-derived Cone Viability Factor，RdCVF）

最初认为RdCVF是一种视锥细胞存活的必需因子，只由视杆细胞分泌，但最近发现视网膜内层主要是双极细胞也能分泌RdCVF，它与硫氧还蛋白家族同源，可能通过抗氧化应激和细胞因子活性的双功能来保护视锥细胞^[39-40]。RP23H大鼠玻璃体腔内注射RdCVF不但能增加视锥细胞的量，而且ERG振幅增大，说明RdCVF不但能营救视锥细胞，而且能保存其功能，因此有望成为RP患者保持残存中心视力的重要方法^[41]。视杆细胞变性如何导致双极细胞失去分泌RdCVF的功能以及如何恢复是需要进一步研究的课题。

四、药物治疗

针对RP的不同发病机制，有维生素类、抗氧化剂、钙离子阻断剂等多种药物用于RP的治疗。

1.      维生素类

维生素A棕榈酸酯是最常用于RP治疗的药物，虽然对其疗效一直存在争议，但它是合成视紫红质的重要物质，缺乏时会产生夜盲。Berson^[42]等研究表明，RP患者补充维生素A棕榈酸酯150001U／d，ERG振幅下降速率减慢，但维生素A棕榈酸酯150001U／d联合应用维生素E 400IU/d，似乎会加速疾病的发展。也有专家质疑大剂量维生素A的毒性反应，Sibulesky对146例每日补充维生素A棕榈酸酯150001U的RP患者随访12年，结果表明这个剂量是安全的^[43]。最近Berson等对225例非吸烟RP患者随访4年的研究表明，维生素A棕榈酸酯15000IU／d联合芦丁12mg/d能减慢患者中周部视野的丧失^[44]。还有二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid, DHA)、烟碱等也对RP治疗有一定的疗效^[45-46]。

2.  抗氧化剂

视杆细胞死亡后继发的视锥细胞死亡主要是由氧化损伤引起。研究认为视网膜上耗氧量最大的视杆细胞死亡后，视网膜外层供氧量显著增加，引起了视锥细胞的氧化损伤。研究表明，给予RP小鼠腹腔内注射一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase, NOS）抑制剂混合物或抗氧化剂混合物，能明显减少氧化标志物的产生，增加视锥细胞的密度^[47-48]。

3. 钙通道阻滞剂

细胞内钙离子浓度升高可以诱发凋亡发生，因此钙通道阻滞剂是通过抑制光感受器细胞的凋亡来治疗RP。地尔硫卓、尼伐地平等都有保护视网膜变性小鼠光感受器细胞的功能^[49]。

4. 药物分子伴侣（pharmacological chaperon）

药物分子伴侣是近年来兴起的治疗因基因突变引起蛋白质错误折叠运输缺陷等遗传性疾病的新疗法。这类化合物一般为目的蛋白的底物类似物、受体配基或酶抑制剂等化学小分子，具细胞通透性，能在内质网中特异性识别并结合突变蛋白，校正并稳定其正确构象，协助其运输到正确位点，恢复突变蛋白功能。目前报道治疗RP的药物分子伴侣有类维生素A、丙戊酸^[50-51]。而分子伴侣诱导剂（类格尔德霉素、根赤壳菌、17-AGG）和自我吞噬诱导剂（雷帕霉素）等也通过体内“质控系统（quality control system）”来促进错误折叠蛋白降解、吞噬来发挥治疗作用^[52]。

五、视觉假体

自1929年发现电刺激视皮质可以产生光幻视以来，到目前世界上有超过20多个研究小组致力于人工视觉的研究^[53]，旨在通过人工装置即视觉假体对视觉神经系统进行作用，从而在视觉中枢产生光幻视，实现视觉功能修复。目前用于临床研究的视觉假体，根据刺激位置的不同分为视皮层假体、视神经假体、视网膜假体。对于RP晚期患者来说，虽然视网膜外层细胞变性、凋亡，但视网膜内层细胞相对保存良好，因此多采用视网膜假体。2003年Humayun报道了第一例RP患者视网膜假体植入^[54]，目前已有不少科研机构的视网膜假体如EPIRET3、ArgusⅡ等进入到临床实验阶段^[55-56]。初期研究表明，植入眼内的EPIRET3具有很好的耐受性，术后只引起短暂的中度炎症，在眼内位置稳定^[55]；患者能感知图形刺激^[57]。Humayun等报道了21例接受ArgusⅡ植入术后6个月结果，患者找门、线路辨认和定位以及移动能力有明显提高，87%患者用触摸屏定位高对比度方格测试结果提高^[56]。但由于视觉假体获得的视力不同与正常视力，最重要的是要培训植入者重新学习“看”东西，包括光感知、物体运动、物体辨别和定位，以提高患者在陌生环境中的活动能力。

基因治疗是针对病因进行治疗，是解决问题的根本，但RP遗传的高度异质性使得仍有一半的基因未发现，因此在积极开展RP基因诊断的同时，还要积极探讨RP发病的共同分子病理机制，针对各共同环节采取抗凋亡、神经营养等综合治疗手段。而以干细胞为基础的移植治疗和视觉假体植入则为晚期患者带来了希望。

 

参考文献   

1.        Buch, H. Vinding T, La Cour M,et al. Prevalence and causes of visual impairment and blindness among 9,980 Scandinavian adults: the Copenhagen City Eye Study. Ophthalmology, 2004; 111(1): 53–61